MTZ² Lite v1.0: Manual de Referencia Científica y Protocolos Experimentales en Bio-Imagen 3D/4D

Dónde está cada cosa en la pantalla

Antes de la metodología, la orientación. Esta tabla dice exactamente qué pulsar para llegar a cada módulo. Los asistentes de análisis se eligen desde el árbol Surpass (pestaña 🌳 Surpass Tree del panel izquierdo) y se abren en la pestaña contigua ⚙️ Asistentes: al hacer clic en un elemento del árbol, la aplicación cambia sola a esa pestaña y muestra su asistente.

Su cuenta

MTZ² se abre con una cuenta de Google desde intelligentia.dev/mtz+mgd/: botón Entrar con Google. La primera vez se crea la cuenta; no hay contraseña que recordar. Sus imágenes no se suben: se abren y se procesan en su navegador, igual que antes.

• Su chip de iniciales, arriba a la derecha: Mi cuenta y Cerrar sesión. En el teléfono, en la hoja ⋯ Más.
• Mi cuenta enseña todo lo que se guarda (nombre, correo, fechas de acceso), lo descarga en JSON y permite eliminar la cuenta al instante.
• Contacto y soporte: Ayuda › Contacto y soporte, o directamente imagine@intelligentia.dev.

Ejemplos completos, paso a paso

Cuatro trabajos habituales, de principio a fin. Cada uno se puede seguir sin haber leído el resto del manual; los capítulos que explican el porqué se citan al final de cada receta.

R.1 Contar núcleos y medir su área

Punto de partida: una imagen con núcleos teñidos, por ejemplo en azul.

Detalle y fundamento: capítulo 6. Resolución de carga: sección 2.4 bis.

R.2 Limpiar el resultado a mano

Punto de partida: ya ha creado superficies, pero sobran unas cuantas.

Detalle: capítulo 12.

R.3 Comparar dos marcadores en la misma imagen

Punto de partida: dos canales adquiridos, por ejemplo azul y verde.

Detalle: capítulo 9.

R.4 Preparar una figura para publicar

Detalle: capítulos 12 y 13.

R.5 Exportar mallas 3D para Impresión 3D (STL) y Animación / CAD (OBJ)

Detalle: capítulos 6 y 16.

R.6 Cargar adquisiciones nativas de Zeiss (.CZI) y Leica (.LIF) sin conversión

Detalle: capítulos 2 y 16.

R.7 Diagnóstico de penetración axial y aberraciones en modo maximizado (Vistas Canónicas)

Punto de partida: Una serie confocal Z de tejido neuronal o esferoide tumoral donde se sospecha atenuación fotónica en profundidad o elongación por focal shift.

Detalle: capítulos 4 y 11.

R.8 Configuración ergonómica del puesto de trabajo multimonitor (PanelManager)

Punto de partida: Estación de trabajo de bioimagen con dos monitores o pantalla ultra-ancha (UltraWide), donde se desea un visor 3D despejado a 60 FPS sin perder acceso a asistentes y métricas.

Detalle: capítulo 11 (sección 11.6).

R.9 Verificación de trazabilidad FAIR y series multicorte en la cabecera (MUESTRA:)

Punto de partida: Un lote de archivos TIFF correspondientes a una serie confocal numerada (ej. célula01_Z001.tif ... célula01_Z040.tif).

Detalle: capítulos 2 y 12.

Novedades de esta versión (Builds 018893 a 018900)

Resumen de los cambios de esta versión, con el motivo científico de cada uno y el capítulo donde se explica en detalle. Todos se verificaron con medidas objetivas antes de publicarse; las cifras que se citan son las obtenidas en esas pruebas.

Asistente de IA: experto médico-científico que trabaja en la aplicación

El asistente cumple dos funciones a la vez. Como consultor responde con el criterio de un doctor con experiencia investigadora y clínica en microscopía óptica, anatomía patológica, microbiología, biología celular y molecular médica, genética y bioestadística. Como operador ejecuta el análisis en la aplicación: carga, segmenta, cuenta, mide, compara canales, sigue objetos en el tiempo, prepara figuras y redacta los métodos, y lee el resultado de cada paso antes de dar el siguiente.

Cómo abrirlo y configurarlo

1. Ábralo desde la pestaña IA del panel derecho, el botón 🤖 Asistente IA de la cabecera o Ctrl/⌘ + K. En modo de voz IA, las órdenes habladas también le llegan a él.
2. Pulse ⚙ para abrir el Hub de IA, elija el proveedor, pegue su clave de API y el modelo, pulse Probar y Guardar. El punto verde de la cabecera del panel indica que está listo.
3. Escriba o dicte el objetivo. Intro envía; Mayús + Intro inserta una línea; Parar (o Esc en la caja de texto) detiene al asistente en cualquier momento.

Qué puede hacer

Lo que borra o sustituye trabajo —cerrar la imagen, cargar otra encima de unos resultados, pulsar un control de borrar— pide su autorización en una tarjeta «¿Lo autoriza?». Si responde «No», el asistente no lo vuelve a intentar salvo que usted lo pida.

Cómo trabaja

Cada petición se resuelve en un bucle: el modelo decide qué herramienta necesita, la aplicación la ejecuta y le devuelve el resultado medido, y el modelo decide el paso siguiente, hasta cumplir el objetivo (como máximo 16 vueltas por petición). Cada paso aparece en la conversación con su resultado; al desplegarlo se ven los datos exactos que recibió el modelo. Los parámetros se escriben en los mismos campos de los asistentes, de modo que usted ve en pantalla con qué se ha medido y puede retocarlo.

• Ninguna cifra que no haya devuelto una herramienta. Si algo no se ha medido, lo dice y ofrece medirlo.
• Medida frente a modelo: área y volumen se cuentan de vóxeles; el diámetro equivalente supone forma circular o esférica.
• Calibración: advierte cuando las micras dependen de una calibración por defecto o no verificada.
• Limitaciones: señala objetos cortados por el borde, saturación, n pequeña, anisotropía axial y pseudorreplicación (las células de una misma imagen no son réplicas biológicas).
• Fuentes: fundamenta la teoría en este Manual y cita el apartado.

Ejemplos de peticiones por disciplina

Resolución de problemas

Segmentación automática al cargar: método, validación y límites

Al abrir una imagen, MTZ² segmenta por sí sola los objetos del canal nuclear y los muestra con sus medidas, sin que el usuario tenga que ajustar nada. Los parámetros no son fijos: se miden sobre cada imagen, porque el tamaño de los núcleos en píxeles, el ruido y la iluminación cambian con el objetivo, la cámara, la tinción y el tejido. Con parámetros fijos, la segmentación de referencia apenas encontraba núcleos enteros (F1 = 0,005).

Qué ocurre al cargar

1. Elección del canal. El que el fichero nombra como DAPI, Hoechst, DRAQ5 o núcleo; si no hay nombre, el de emisión inferior a 500 nm o el pintado en azul; si no, el canal con más señal. Nunca un canal derivado ni uno vacío.
2. Autoajuste (en un hilo de cálculo aparte, sin bloquear la interfaz): tamaño típico de los objetos, suavizado, tipo de umbral y criterio de separación.
3. Segmentación y medida de cada objeto: área (2D) o volumen (3D), diámetro equivalente, intensidad media y máxima, posición.
4. Representación: en 2D, contornos amarillos trazados por los bordes de los píxeles, sin tapar la imagen; en 3D, superficies. El asistente de Superficies muestra los valores medidos y la nota «Parámetros medidos sobre esta imagen».

El método

1. Plano de trabajo. En una pila, el plano con más señal. Si el plano supera 1024 píxeles de lado se reduce promediando bloques (nunca saltando píxeles), sólo para medir los parámetros.
2. Campo vacío. El umbral de Otsu separa dos poblaciones con contraste $\Delta$. El ruido se estima de la diferencia entre píxeles vecinos, que mide la fluctuación y no las estructuras: $$\hat\sigma = \frac{1{,}4826\,\operatorname{mediana}\lvert I_{x+1}-I_x\rvert}{\sqrt{2}}$$ Si $\Delta < 4\hat\sigma$, el campo se declara vacío: «no hay objetos que destaquen del ruido de fondo». Así no se inventan objetos en un pocillo sin células.
3. Barrido de suavizado. Se prueban filtros gaussianos de $\sigma \in \{0; 1; 1{,}5; 2; 3; 4; 6; 8; 12\}$ píxeles (deteniéndose cuando $\sigma$ supera la quinta parte del diámetro). En cada uno se umbraliza y se mide la compacidad de las regiones, $C = 4\pi A / P^2$, como mediana ponderada por área. Se elige el menor $\sigma$ que alcanza el 95 % de la compacidad máxima: suficiente para quitar el granulado, no tanto como para fundir núcleos vecinos.
4. Diámetro típico. $d = 2\times$ la mediana, ponderada por área, de la profundidad máxima de cada región en la transformada de distancia euclídea.
5. Umbral local. Otsu en regiones de lado $3d$, que siguen las variaciones de iluminación. Si el «objeto típico» mide más de 1/6 del campo (un organismo entero autofluorescente, un corte con halo), se repite con regiones de 1/8 del campo.
6. Separación de objetos en contacto por persistencia. Las semillas son los máximos de la transformada de distancia cuya prominencia supera $h = 0{,}2\,r$ (h-máximos); desde ellas se inunda la máscara (cuencas). Corta por las cinturas reales entre núcleos y no por rectas, y no deja sin semilla a los núcleos pequeños.
7. Filtro de tamaño. Del 5 % al 400 % del área nominal $\pi (d/2)^2$ en 2D, y del 5 % al 600 % del volumen nominal en 3D. Para un núcleo de 10 µm: de 3,9 µm² a 314 µm².

Validación

Se comparó contra segmentaciones manuales de expertos de dos colecciones públicas de referencia, con particiones de prueba no usadas para ajustar el método. Un objeto cuenta como acierto cuando su intersección sobre unión con el anotado supera 0,5: $$\text{IoU} = \frac{|A\cap B|}{|A\cup B|},\qquad P = \frac{VP}{VP+FP},\quad R = \frac{VP}{VP+FN},\quad F_1 = \frac{2PR}{P+R}$$

En total se evaluaron 29 438 núcleos anotados. La separación por persistencia superó a la separación por espaciado de semillas en 297 de 374 imágenes, y los campos sin células se declararon vacíos.

Cuándo intervenir a mano

• Si modifica cualquier parámetro (pasos 2 a 5 del asistente), manda su valor y desaparece la nota de autoajuste. «✨ Autoajustar a esta imagen» vuelve a medir.
• Mover el deslizador del umbral pasa al modo «Corte fijo que yo declaro».
• Núcleos tenues en un tejido muy denso: el Otsu local puede dejarlos fuera; baje el umbral o reduzca el lado de región.
• Tinciones citoplasmáticas o de membrana: el método busca objetos compactos; use el clasificador o los contornos manuales.
• Objetos del tamaño del límite de difracción (vesículas, señales FISH): use Puntos, no Superficies.

Pilas 3D con vóxel anisótropo

La validación anterior es 2D. En 3D, el suavizado se aplica con el mismo σ en micras en los tres ejes, es decir, con menos vóxeles en Z cuando el paso axial es mayor que el píxel. Hasta el Build 018900 se usaba en Z el σ en vóxeles de XY: con píxel de 0,2 µm y Δz = 1 µm, el suavizado axial era cinco veces el previsto y fundía en Z núcleos vecinos. En un banco 3D con verdad conocida (42 núcleos por escena, textura de cromatina, PSF confocal, ruido de Poisson; pasos Z de 0,3, 0,6 y 1 µm; núcleos sueltos y apilados en Z), el cambio sube el F1 de 0,738 a 0,982 con núcleos sueltos y de 0,668 a 0,937 con núcleos apilados, el IoU medio de 0,71 a 0,84 y deja las fusiones de 4,2 a 0,5 por escena (sueltos). En 2D el resultado no cambia.

Visualización fiel: la imagen tal como se adquirió (2D, 3D y 4D)

Una medida sólo es interpretable si lo que se ve en pantalla corresponde a lo que registró el detector. MTZ² dibuja las imágenes sin transformaciones que no se declaren, y lo comprueba con pruebas objetivas frente al fichero original.

Imágenes 2D

• Canal lineal: sin corrección de gamma sRGB ni realces ocultos. La ventana con la que se abre es la que guarda el fichero —en un CZI, la de ZEN (color, ventana y gamma de cada canal); en una RGB, el rango completo—; si no guarda ninguna, la automática, que satura el 0,1 % más oscuro y el 0,1 % más brillante, como el «Auto» de Fiji. Con la del mínimo al máximo, una fluorescencia de 12–16 bits se veía casi negra: unos pocos píxeles marcan el máximo. Los botones Auto y Completo de cada canal la cambian; nada de esto altera las medidas.
• Color por canal o tabla de color (Grises, Fire, Viridis, Magma, Inferno, Turbo), y composición aditiva de canales. Con un solo canal, una tabla deja ver diferencias de intensidad que en un tono se confunden; las LUT de Leica y las paletas de ZEN que traiga el fichero se aplican solas.
• Resolución nativa hasta el límite de textura de la tarjeta gráfica. Al alejar se usan mipmaps trilineales (equivalente a una reducción de calidad); al acercar, el píxel tal cual, sin interpolar intensidades que no se midieron.
• Orientación del fichero: la fila 0 del dato arriba en la vista 2D, y la misma convención en 3D.

Volúmenes 3D

1. Resolución nativa mientras quepa en la tarjeta (lado máximo de textura 3D, normalmente 2048) y en un presupuesto de memoria de vídeo (512 MB en escritorio; 128 MB en táctiles o equipos con poca memoria). Si hay que reducir, se hace primero en el eje de vóxel más fino: en XY, por el factor justo para llegar al límite (un mosaico de 4969 × 6254 px queda en 1628 × 2048, con factor 3,05; con 4, el siguiente entero, quedaría en 1243 × 1564); en Z, por planos enteros. Cada vóxel de la textura promedia los que le caen en modo Blend o toma su máximo en MIP, que así no pierde un punto brillante de un vóxel. Una pieza de más de 2048 px de lado se ve en 3D reducida (el análisis, no), y conviene mirarla también en 2D o en ortogonales, a resolución nativa.
2. Profundidad de bits: datos de más de 8 bits (12, 14, 16 bits) se guardan en coma flotante de 16 bits (error inferior a 1 cuenta en 12 bits; con 8 bits eran 8 cuentas y aparecían escalones con ventanas estrechas). Los de 8 bits, sin pérdida.
3. Color premultiplicado: en MIP la intensidad en pantalla es la del dato (tonos bajos 24,5 → 25,0; medios 96,1 → 95,4 niveles, sin ajuste alguno). Antes los tonos medios se veían a menos de la mitad.
4. Opacidad Blend por vóxel atravesado (según la dirección del rayo con vóxeles anisótropos), con rampa cuadrática para que el fondo tenue no vele el interior.
5. Muestreo del rayo sin anillos: cada píxel empieza a muestrear con su propio desfase y, donde el rayo entra en el tejido, ese tramo se recorre a un téxel por muestra. Mientras gira, la calidad adaptativa baja los pasos para ir fluida; al soltar la vista, y al exportar, se traza un fotograma con más pasos. Antes, con pocos pasos, la superficie salía en anillos concéntricos claros y oscuros («vetas de madera») que no están en el dato. En un volumen de prueba con un paso de unos 10 vóxeles, la imagen pasa de 28 a 46 dB de PSNR frente a la de 1000 pasos.
6. Planos muy separados: si el paso en Z es mucho mayor que el píxel (una adquisición de lightsheet de órgano entero con planos cada 100 µm y píxel de 1,9 µm, por ejemplo), cada plano es en 3D una loncha gruesa y la superficie curva del órgano se ve en escalones, como las curvas de nivel de un mapa. Es el dato, no el trazado: entre dos planos no se midió nada, y cualquier visor 3D que interpole lo mostrará igual. La textura fina está en cada plano: mírela en 2D o en ortogonales.

Blend o MIP: cuál usar

• MIP (proyección de máxima intensidad): estructuras brillantes y dispersas —puntos, vesículas, filamentos, vasos—. Muestra todo lo brillante a lo largo del rayo, pero no la profundidad relativa.
• Blend (composición): relaciones espaciales y oclusión. Suba el mínimo de la ventana por encima del fondo de la muestra para que el fondo no vele el interior.

Series 4D

Al reproducir, cada instante carga su propio volumen y se rehacen las superficies si su canal cambia. El tiempo mostrado es instante × intervalo, con el intervalo declarado en el asistente de Seguimiento (el mismo que se usa para calcular velocidades).

Aplicaciones biomédicas: casos resueltos por disciplina

Casos típicos de investigación biomédica resueltos de principio a fin: pregunta, adquisición recomendada, pasos en MTZ², petición equivalente al asistente de IA, cómo informar el resultado y controles imprescindibles. Los valores numéricos de los ejemplos son ilustrativos; los criterios clínicos se citan como referencia y deben comprobarse en la versión vigente de cada guía.

Muestreo necesario según el objeto (referencia)

Resolución confocal (pinhole de 1 unidad Airy): lateral $d_{xy} \approx 0{,}51\,\lambda/\mathrm{NA}$; axial $d_z \approx 0{,}88\,\lambda / \left(n - \sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}\right)$. Criterio de Nyquist: tamaño de vóxel $\le d/2{,}3$. Para un 63×/1,40 en aceite ($n = 1{,}518$) y emisión a 520 nm: $d_{xy} = 189$ nm y $d_z = 491$ nm, de modo que el píxel debe ser $\le 82$ nm y el paso en Z $\le 214$ nm.

Anatomía patológica: índice de proliferación Ki-67 por inmunofluorescencia

Microbiología: viabilidad bacteriana y biopelículas

Genética y citogenética: FISH en núcleos en interfase

Biología celular: índice mitótico y morfología nuclear

• Segmente los núcleos y ordene la tabla de objetos por área y por intensidad media, o compare sus distribuciones en Vantage 1D: la cromatina condensada (profase a anafase) y la apoptótica aparecen como núcleos pequeños y muy brillantes.
• Enseñe al clasificador unos ejemplos de cada clase y confirme con un marcador específico (fosfo-histona H3 para mitosis; caspasa-3 activa o TUNEL para apoptosis).
• Informe el índice como proporción con su intervalo de confianza e indique el número de réplicas biológicas.

Neurociencia: arborización dendrítica y espinas

• Filamentos traza el árbol desde el soma: longitud total, ramas, puntos de bifurcación y perfil de Sholl (intersecciones frente a distancia al soma); el radio crítico es el de máximo número de intersecciones.
• Espinas: cabeza, cuello y clasificación morfológica (mushroom, thin, stubby, filopodia); diámetro por FWHM transversal y por esfera inscrita.
• Adquiera con Nyquist en Z: con un paso de 1 µm las espinas se deforman axialmente.

Microcirculación y dinámica celular

• Red vascular: filamentos del canal endotelial (p. ej. CD31) → longitud, densidad y diámetros.
• Eritrocitos o leucocitos en el tiempo: Seguimiento con el intervalo real entre instantes → velocidad, desplazamiento y MSD (lineal: difusión; curvado hacia arriba: transporte dirigido).
• Declare el intervalo real: todas las velocidades escalan con él.

Colocalización en investigación de enfermedades

Fundamentos Biofísicos y Arquitectura del Motor Surpass 3D/4D

MTZ² Lite es una plataforma de análisis bio-óptico de alta resolución diseñada para la reconstrucción volumétrica, segmentación geométrica y modelado cuantitativo de datos de microscopía de fluorescencia tridimensional y series temporales (4D).

A diferencia de los visores 2D ortogonales convencionales, el módulo Surpass Space implementa un espacio afín tridimensional calibrado intrínsecamente en unidades métricas absolutas (micrómetros, $\mu m$). El motor gráfico WebGL ejecuta dos algoritmos primarios de proyección volumétrica:

• Raycasting Blended (Mezcla de Emisión/Absorción): Modela la integración numérica de la ecuación de transporte radiativo a lo largo de los rayos proyectados desde el plano focal de la cámara virtual a través de la rejilla tridimensional de vóxeles. Este modo preserva gradientes internos y densidades continuas en preparaciones de tejido espeso o cultivos celulares enteros.
• Maximum Intensity Projection (MIP): Asigna a cada píxel de proyección el valor escalar máximo detectado a lo largo del rayo axial:

El algoritmo MIP resulta óptimo para visualizar estructuras filamentosas de alta intensidad (e.g., microtúbulos, árboles dendríticos neuronales, capilares fenestrados) sobre fondos autofluorescentes tenues.

1.1 Optimización de Marcha de Rayos: Empty-Space Skipping

En el sombreador de fragmentos volumétrico WebGL (gpuVolume.js), la ecuación de transporte radiativo se aproxima mediante muestreo de paso uniforme a lo largo del rayo $\mathbf{r}(t) = \mathbf{o} + t \mathbf{d}$. En bio-imágenes de fluorescencia confocal o multifotónica, el espacio de fondo (vóxeles sin fluoróforo o por debajo del ruido térmico del detector) suele representar entre el 75 % y el 92 % del volumen total.

El motor incorpora empty-space skipping dinámico: al evaluar la muestra volumétrica, si $\max(\text{RGBA}) < 0{,}002$, el rayo reconoce que se encuentra en espacio no emisor y avanza con paso doble ($\Delta t_{\text{skip}} = 2 \times \Delta t$), omitiendo la costosa interpolación trilineal y el cálculo de gradientes. Esta técnica reduce la carga de la GPU en un factor de 3× a 5×, manteniendo 60 FPS estables incluso en pilas volumétricas de alta densidad.

1.2 Volúmenes grandes: lectura por trozos y análisis por bloques

Una pila de microscopía puede ocupar varios gigabytes. Para que eso no se convierta en un límite de tamaño de fichero ni en una reducción silenciosa de la resolución, la aplicación:

• Lee el fichero por trozos: primero su estructura y después cada plano cuando hace falta, sin cargarlo entero (capítulo 2.1 bis).
• Analiza por bloques con márgenes los volúmenes grandes (segmentación, puntos), con las magnitudes globales —umbral, nivel de ruido, tamaño típico— calculadas sobre la imagen completa: el resultado es el mismo que con el volumen entero.
• Malla plano a plano: Marching Cubes guarda sólo dos planos de valores y los vértices de sus aristas, y cuenta los objetos por tramos de vóxeles consecutivos; la malla es la misma, vértice a vértice, con una fracción de la memoria.
• No duplica los datos sin necesidad: la colocalización calcula los rangos de Spearman sin guardarlos por vóxel, la huella SHA-256 se calcula por tramos y la copia de la textura se libera en cuanto está en la tarjeta gráfica.

1.3 Desacoplamiento de resolución: textura para ver, datos nativos para medir

Para que el rendimiento del visor 3D no degrade la capacidad analítica, la textura de la GPU y los datos de análisis son independientes:

• Textura WebGL 3D: a la resolución nativa del dato mientras quepa en la tarjeta gráfica (lado máximo de textura 3D, normalmente 2048) y en un presupuesto de memoria de vídeo; si hay que reducir, por bloques enteros promediados (Blend) o por su máximo (MIP), con datos de más de 8 bits en coma flotante de 16 bits. La calidad del trazado se adapta sola a la potencia del equipo (capítulo Visualización fiel).
• Datos de análisis: a resolución nativa mientras quepan en la memoria asignada a la imagen (1,6 GB por defecto, ampliable a 8 GB en el diálogo de importación; capítulo 2.1 bis). Así la segmentación, la morfometría y la colocalización operan sobre los vóxeles que adquirió el microscopio; si la imagen no cabe, se remuestrea en XY y se declara.

1.4 Renderizado Instanciado de Gran Escala (THREE.InstancedMesh)

Cuando el módulo de detección sub-vóxel identifica miles de vesículas o spots fluorescentes (por ejemplo, 3.500 vesículas sinápticas), el motor gráfico no crea miles de geometrías individuales en el grafo de Three.js (lo que colapsaría el pipeline por exceso de draw calls). En su lugar, empaqueta todas las coordenadas $x, y, z$, radios y colores en un único búfer instanciado (InstancedMesh), despachando todos los objetos a la GPU en una única llamada de dibujado y reduciendo el tiempo de CPU de 45 ms a 0,3 ms por fotograma.

1.5 Control de Densidad de Pantalla: Límite DPR $\le 2$

En pantallas de muy alta resolución (pantallas Retina 4K/5K), el escalado nativo del framebuffer forzaba a la GPU a evaluar más de 15 millones de fragmentos por frame. Al fijar el Device Pixel Ratio en un máximo de 2.0, el número de fragmentos a procesar se reduce en un 55 % sin pérdida apreciable de nitidez visual, erradicando el sobrecalentamiento del equipo.

Protocolo de Carga, Importación y Calibración de Datos

Este capítulo es el más importante del manual para quien vaya a publicar. Todas las magnitudes en $\mu m$, $\mu m^2$ y $\mu m^3$ que produce la aplicación son un recuento de vóxeles multiplicado por la calibración. Un error aquí no aparece como un fallo visible: aparece como números plausibles y equivocados.

2.1 Formatos admitidos

Validación. El lector TIFF coincide píxel a píxel con tifffile en 12 ficheros que cubren cada compresión, los predictores, BigTIFF, orden de bytes big-endian, RGB por planos, teselas e hyperstacks de ImageJ. Los de CZI y LIF coinciden píxel a píxel con czifile y readlif, los lectores de referencia en Python, en ficheros de prueba construidos según la especificación (CZI sin comprimir, Zstd con dos escenas y Zstd en mosaico; LIF de dos series) y en adquisiciones reales: cinco CZI —tres de Zeiss Lightsheet de cerebro de ratón, con dos vistas, dos iluminaciones o un mosaico de 2 × 2; un mosaico de lightsheet de 32 teselas y 4,5 GB, y un campo de 5 canales— y dos proyectos LIF de Leica (2 series de 3 canales a 8 bits y 15 series a 16 bits, con pilas de hasta 177 planos). En los de Lightsheet se comprobó cada vista, cada iluminación por separado y su fusión por la media. Aun así, con el primer fichero de su microscopio, compare las dimensiones, la calibración y la intensidad de un píxel con lo que muestra ZEN o LAS X.

2.1 bis Ficheros grandes: cómo se leen y cuánta memoria usan

El fichero no se carga entero. Se leen primero su estructura (cabeceras, directorios, metadatos) y después cada plano cuando hace falta, así que no hay límite de tamaño de fichero; antes, Chrome y Edge no abrían ninguno de más de 2 GB y Safari ninguno de más de unos 4 GB. Lo que sí tiene límite es la imagen que se analiza, porque tiene que estar en la memoria del ordenador:

• Memoria para la imagen. Por defecto, el 20 % de la memoria que declara el navegador, entre 0,5 y 2 GB. Chrome no declara más de 8 GB aunque el equipo tenga más, así que en la práctica son 1,6 GB (0,5 GB en móviles y tabletas). En el diálogo de importación, Memoria para la imagen permite subirla a 3 o 4 GB en equipos con 16 GB de RAM, y a 6 u 8 GB con 32 GB o más. La elección se recuerda en ese navegador.
• Si la imagen no cabe, se remuestrea en XY lo justo para que quepa, con el vóxel reescalado por el mismo factor (apartado 2.4); el diálogo dice cuánto ocuparía a resolución nativa y el banner de importación declara el factor aplicado.
• Memoria durante el análisis. El análisis se hace en segundo plano sobre una copia del canal, así que en algunos momentos el navegador necesita unas 2,4 veces la memoria de la imagen: con 2,3 GB de imagen, unos 5,4 GB libres. El diálogo lo advierte al elegir más memoria de la automática.
• Límite por canal: 2³¹ − 1 vóxeles (unos 4 GB en 16 bits).

Los volúmenes grandes se analizan por bloques, a resolución nativa: la segmentación por encima de 16 millones de vóxeles por canal y la detección de puntos por encima de 32 millones. Lo que no es local —el umbral de Otsu, el mapa de umbrales por regiones, el tamaño típico de los objetos o el nivel de ruido de la respuesta DoG— se calcula sobre la imagen completa, y cada bloque lleva un margen mayor que el alcance de sus filtros, de modo que el resultado es el mismo que con el volumen entero: en las pruebas, los mismos objetos (F1 = 1,000) y los mismos puntos con las mismas medidas. Un objeto mayor que el margen puede quedar recortado por el borde de un bloque; se cuenta y se avisa. El mallado de superficies recorre la pila plano a plano.

En paralelo. Con varios núcleos, los bloques se reparten entre workers (uno por núcleo libre, hasta seis, y los que quepan en unos 768 MB). Cada worker recibe un bloque cuando queda libre; las cantidades globales se combinan y las etiquetas se aplican en el orden de los bloques, así que el resultado es idéntico al de un solo hilo (comprobado con la huella de las etiquetas completas en Chrome y en Safari). En la pila de 630 MB, la segmentación pasa de 12 a 4,3 s y la detección de puntos de 38 a 14 s.

Para volúmenes de decenas o cientos de gigabytes que haya que analizar enteros a resolución nativa, una estación de trabajo con Imaris (formato .ims multirresolución) o Fiji con BigDataViewer sigue siendo la herramienta adecuada.

2.2 Calibración: de dónde debe salir

El tamaño de vóxel no es recuperable de un PNG. Debe tomarse del software de adquisición, donde figura como pixel size (o scaling) y z-step:

• Leica LAS X: Acquisition → Format → Pixel size
• Zeiss ZEN: Info → Scaling (X/Y/Z)
• Nikon NIS-Elements: Calibration → Recalibrate
• Olympus cellSens: propiedades de la imagen, campo Calibration

Por ello la aplicación solicita la calibración antes de importar, en un diálogo que muestra en tiempo real la rejilla de trabajo resultante, el vóxel efectivo y el campo de visión físico. Si se dejan los valores por defecto, la calibración queda marcada como asumida y así consta en el registro de procedencia y en el párrafo de Métodos, con la advertencia de que un valor asumido no es publicable.

2.3 OME-TIFF: la calibración viaja con el dato

2.3 bis Pilas multicanal: cómo se separan los canales

Aquí hay una diferencia con la fotografía digital que conviene entender, porque equivocarla destruye datos en silencio.

Una fotografía en color guarda sus tres canales dentro de cada píxel («muestras por píxel»). Una pila confocal no: cada canal es una página independiente del archivo, y las páginas van intercaladas con los planos Z en un orden que el fichero declara. Una adquisición de 5 canales y 20 planos son 100 páginas.

• Con OME-XML: el archivo declara SizeC, SizeZ, SizeT y DimensionOrder. La aplicación desintercala las páginas según ese orden — sea XYCZT, XYZCT o cualquier otra combinación — y lo indica en el diálogo de importación antes de cargar nada. Los nombres de canal del fichero (DAPI, Alexa488…) se conservan.
• Sin OME-XML: no hay forma de deducir el reparto de los píxeles, así que el diálogo muestra un selector para que usted declare cuántos canales hay. Si no lo declara, se leen como planos de un solo canal, y así se advierte.
• Imágenes en color (RGB): ahí sí los canales van dentro del píxel, y se leen de las muestras.

El reparto aplicado y su procedencia quedan registrados en el espécimen y en el informe de procedencia. No hay límite de cuatro canales: se admiten los que el archivo contenga.

2.3 ter Series temporales (4D)

Se importan todos los instantes de una serie temporal: los que declaran el OME-XML (SizeT), un hyperstack de ImageJ, un LSM, un CZI o un LIF. El intervalo entre instantes también se lee del fichero —TimeIncrement de OME, finterval de ImageJ, TimeInterval de LSM, el incremento de T de CZI y la longitud del eje T de LIF entre el número de intervalos— y pasa directamente al reproductor y al seguimiento, de modo que las velocidades y los coeficientes de difusión salen en µm/s sin teclear nada. Si el fichero no lo declara, el valor por defecto (1 s) se puede cambiar en Seguimiento. La memoria de la imagen cuenta todos los instantes.

2.4 Remuestreo y conservación del campo de visión

Cuando la pila supera la resolución de trabajo seleccionada, se remuestrea en XY. En ese caso el tamaño de vóxel se reescala por el mismo factor, en la misma operación, de modo que el campo de visión físico se conserva exactamente:

Esta invariante está cubierta por una prueba automática dedicada: un campo de $2048 \times 1536$ px a $0{,}104\ \mu m$/px conserva su campo de $212{,}992 \times 159{,}744\ \mu m$ para cualquier factor de reducción. La proporción de aspecto también se preserva; una imagen no cuadrada nunca se deforma a cuadrada.

El remuestreo reduce la resolución espacial efectiva: valórelo antes de medir estructuras finas. La aplicación informa del factor aplicado en el banner de importación y lo registra en la procedencia.

2.4 bis Resolución de carga: por qué importa para contar

Al importar, el diálogo pregunta a qué resolución trabajar. La respuesta correcta cuando vaya a contar o medir objetos es Nativa, y la razón es concreta: remuestrear encoge los objetos.

Por debajo de unos ocho píxeles por objeto ningún algoritmo puede separarlos, y el recuento que salga medirá el ruido troceado, no las células. La visualización 3D se limita por su cuenta, con independencia del dato cargado, así que trabajar en nativa no ralentiza el visor ni consume memoria de vídeo de más.

El procedimiento completo, con el ejemplo de contar núcleos, está en el capítulo 6, Superficies.

2.5 Cerrar una imagen y abrir otra

No hace falta cerrar para abrir otra imagen. Importar sustituye el conjunto de datos activo y descarta todo lo derivado del anterior: mediciones del calibre, puntos detectados, filamentos, trayectorias, métricas de isosuperficie y las anotaciones y el modelo del clasificador. Esto no es cortesía de interfaz sino una condición de corrección: una medida de la imagen anterior mostrada junto a la imagen actual es indistinguible de una medida de esta última.

Las anotaciones del clasificador ilustran por qué. Son índices de vóxel del volumen sobre el que se pintaron, de modo que conservarlas al cambiar de imagen no envejecería el modelo: lo entrenaría con etiquetas que señalan vóxeles sin ninguna relación con lo que el usuario marcó.

Cuando aun así quiera partir de un estado vacío y verificable, use Archivo › ✕ Cerrar imagen y borrar resultados. La aplicación queda sin imagen, el banner lo declara y los indicadores muestran «—» en lugar de ceros: no se ha medido nada, que no es lo mismo que se ha medido cero.

2.6 Profundidad de bits y canales

Los datos de 8, 12 y 16 bits se guardan en 16 bits, sin pérdida: un TIFF de 12 o 16 bits conserva íntegro su rango dinámico y no se trunca a 8 bits. Los de 32 bits, enteros o en coma flotante, se guardan en coma flotante de 32 bits. En imágenes en color (PNG/JPEG), los canales R, G y B se mapean a los canales 1–3; el cuarto canal es la media aritmética de los tres y se marca como derivado, quedando excluido del análisis de colocalización por las razones expuestas en el capítulo 9.

Carga, Mapeo y Análisis de Secuencias Biológicas (FASTA / GenBank)

En los experimentos modernos de microscopía correlativa, los fluoróforos observados son productos de fusión génica (recombinant fluorescent proteins) o sondas oligonucleotídicas específicas (*in situ* hybridization / MERFISH / seqFISH).

MTZ² Lite incorpora un motor bioinformático nativo (SequenceLoader) que permite cargar e inspeccionar secuencias biológicas en formato FASTA (.fasta, .fa, .fna, .faa) y texto anotado, calculando propiedades moleculares críticas y vinculándolas a los canales ópticos de la reconstrucción 3D.

3.1 Estructura Válida de un Registro FASTA

>EGFP_Human_Actin_Fusion_Construct [Homo sapiens / A. victoria] Ex:488nm Em:507nm
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQ
CFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGH
KLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSK
DPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKMDDDIAALVVDNGSGMCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQ

3.2 Parámetros Calculados Automáticamente

• Determinación del Tipo de Polímero: Clasificación inmediata entre ADN (adenina, guanina, citosina, timina), ARN (uracilo) y Polipéptido/Proteína (20 aminoácidos estándar).
• Masa Molecular Estimada ($M_w$ en kDa): Derivada de la suma ponderada de monómeros constitutivos ($\sim 330\,\text{Da}$ por nucleótido de cadena simple, $\sim 110\,\text{Da}$ por residuo de aminoácido).
• Contenido de GC (%): Calculado para secuencias de nucleótidos según:
  $$ \%GC = \frac{n_G + n_C}{N_{\text{total}}} \times 100 $$
• Detección de Cromóforos Fluorescentes: Identificación de tríadas catalíticas conservadas (e.g., Thr65-Tyr66-Gly67 en EGFP, Met66-Tyr67-Gly68 en mCherry) y enlace directo al canal de microscopía respectivo.

Óptica Confocal, Criterio de Nyquist-Shannon y Corrección Axial

La resolución espacial de un sistema de microscopía óptica de campo amplio o confocal está limitada fundamentalmente por la difracción de la luz, descrita por la función de dispersión de punto (*Point Spread Function*, PSF).

4.1 Límites de Resolución Teórica de Abbe-Rayleigh

donde $\lambda_{\text{em}}$ es la longitud de onda de emisión, $NA = n \sin \alpha$ es la apertura numérica del objetivo y $n$ es el índice de refracción del medio de inmersión.

4.2 Criterio de Muestreo de Nyquist-Shannon

Para evitar el falseamiento de frecuencias (*aliasing*) y reconstruir de forma óptima las morfologías tridimensionales sin pérdida de información de alta frecuencia espacial, el tamaño del vóxel en el plano lateral ($\Delta x, \Delta y$) y axial ($\Delta z$) debe satisfacer:

Gestión Multicanal y Ajuste Espectral (Display Adjustment)

En la pestaña 🎨 Canales LUT, cada canal tiene su propio control de visualización: color o tabla de color, ventana (rango dinámico) y gamma. En 3D se trazan a la vez hasta cuatro canales visibles.

• Ventana con la que se abre: la que guarda el fichero (en un CZI, la de ZEN; en una RGB, el rango completo) o, si no guarda ninguna, la automática, del percentil 0,1 al 99,9 del canal. El nombre «Rango Dinámico» de la tarjeta indica, al pasar el ratón, de dónde salió.
• Auto y Completo: Auto vuelve a la ventana automática; Completo la lleva del mínimo al máximo de los datos, sin recortar nada.
• Tabla de color: Color del canal (negro → color pleno) o una gama: Grises, Fire (la de Fiji), Viridis, Magma e Inferno (uniformes en luminosidad y legibles con daltonismo) y Turbo (arcoíris mejorado). Con un solo canal, como una adquisición de lightsheet a una longitud de onda, la gama deja ver diferencias de intensidad que en un solo tono se confunden.
• Rango Dinámico (Min / Max): Ajusta los puntos negro y blanco. Los valores por debajo del umbral mínimo se mapean a intensidad cero (eliminando autofluorescencia de fondo inespecífica), mientras que los valores por encima del máximo se mapean a saturación plena.
• Corrección Gamma ($\gamma$): Aplica una transformación no lineal a la curva de intensidad:
  $$ I_{\text{out}} = I_{\text{in}}^{\gamma} $$
  Un valor $\gamma < 1.0$ expande los tonos medios y tenues (e.g., filopodios o microtúbulos periféricos) sin sobreexponer las regiones densas (e.g., somas o núcleos).
• Mini-Histogramas en Tiempo Real: Cada tarjeta de canal incorpora un histograma de intensidades en la escala del propio dato (de 0 a su máximo) y en altura logarítmica, con la ventana marcada, para identificar de un vistazo distribuciones bimodales o recorte por saturación (*clipping*).

Superficies: crear objetos a partir de una señal

Superficies es la herramienta principal de la aplicación. Convierte la señal de un canal en objetos medibles: cuenta cuántos hay, mide cada uno, y los deja en el catálogo para revisarlos. Es la vía cuando hay decenas, cientos o miles de células, porque no exige dibujar ninguna.

6.1 Los cinco pasos

El asistente está en Asistentes › 🧊 Superficies, y va en este orden:

1. Canal fuente. La señal de la que nacerá el objeto.
2. Suavizado. Quita el granulado antes de aplicar el corte.
3. Umbral. Qué intensidad se considera señal real y qué es fondo.
4. Separar objetos en contacto, por su diámetro esperado.
5. Rango de superficie, para descartar restos y agregados.

6.2 Ejemplo paso a paso: contar núcleos en un corte de tejido

Partimos de una imagen en la que los núcleos están teñidos en azul. El objetivo es contarlos y medir el área de cada uno.

6.3 Qué es medida y qué no

Superficie y volumen son medidas. Salen de contar los vóxeles que superaron el corte y multiplicarlos por el tamaño de vóxel calibrado. No hay ningún modelo de forma de por medio. Lo mismo la intensidad media y el pico de cada objeto.

El diámetro equivalente es un modelo: el diámetro que tendría el objeto si fuese un círculo o una esfera de ese mismo tamaño. Va marcado como tal, y las esferas que se dibujan en la vista 3D representan esa forma equivalente, no el contorno medido.

Todo depende de la calibración. Si el tamaño de vóxel es erróneo, los recuentos siguen siendo correctos pero cada µm² es falso en la misma proporción. Por eso, sin calibración real, trabaje en vóxeles.

6.4 Después de crear: revisar y corregir

Las superficies creadas van al catálogo de objetos (panel derecho, pestaña 🗂 Objetos). Ahí puede recorrerlas, renombrarlas, cambiarles el color, ocultarlas y borrar las que no procedan — siempre queda constancia de que fueron editadas a mano, y así consta en el CSV y en el párrafo de Métodos. Véase el capítulo 12.

6.5 La malla: cómo se dibuja lo segmentado

La malla se construye por Marching Cubes (Lorensen & Cline, 1987) con la tabla canónica completa de las 256 configuraciones, aplicado a la máscara de los objetos aceptados, no a las intensidades en bruto. Por eso la superficie coincide con los objetos por construcción y no por casualidad. La malla es cómo se dibujan; lo que se mide es el recuento de vóxeles.

6.6 Cierre de la malla y objetos recortados por el borde

El volumen se calcula por el teorema de la divergencia, que sólo es válido sobre una superficie cerrada. En microscopía real la estructura de interés rara vez cabe entera en el campo, de modo que una malla construida directamente sobre el stack queda abierta allí donde el objeto toca el borde, y la integral pierde todo significado físico.

Para evitarlo, el volumen se rellena con un vóxel vacío por cara antes de mallar, garantizando que toda superficie cierre. Adicionalmente se realiza un etiquetado de componentes conexas (conectividad-6) sobre la máscara umbralizada y se informa de cuántos objetos están en contacto con el borde del stack.

6.7 Métricas morfométricas derivadas

• Volumen físico ($V$ en $\mu m^3$): integral de divergencia de Gauss sobre la malla cerrada:
  $$ V = \frac{1}{6} \left| \sum_{i=1}^{N_{\text{tri}}} \mathbf{v}_{i,1} \cdot (\mathbf{v}_{i,2} \times \mathbf{v}_{i,3}) \right| $$
  Los vértices ya están expresados en $\mu m$ mediante la calibración de vóxel, por lo que no se aplica ningún factor de escala adicional.
• Área superficial ($A$ en $\mu m^2$): suma de las áreas euclidianas de las facetas triangulares en el espacio físico calibrado.
• Esfericidad de Wadell ($\Psi$): adimensional, acotada en $(0, 1]$:
  $$ \Psi = \frac{\pi^{1/3} (6V)^{2/3}}{A} $$
  $\Psi \approx 1{,}0$ caracteriza núcleos o vesículas esféricas; una neurona ramificada presenta $\Psi < 0{,}3$.
• Recuento de objetos: componentes conexas por encima del umbral, con el subconjunto que toca el borde declarado por separado.

6.8 Exactitud verificada del módulo

La malla se construye indexada y soldada por arista de rejilla, lo que garantiza que sea cerrada y manifold (cada arista compartida por exactamente dos triángulos) y permite calcular normales suaves ponderadas por área. La exactitud puede comprobarla usted mismo en Reproducibilidad → Validar instrumento:

El área del cubo se mide un 2,5 % por debajo del ideal. No es un defecto: Marching Cubes bisela las aristas vivas, sustituyendo cada arista recta por un chaflán a 45°, lo que retira $2w$ de cara y añade $w\sqrt{2}$ de bisel por unidad de longitud —una pérdida neta de $\approx 0{,}59w$. Es un comportamiento inherente al algoritmo sobre geometría angulosa y debe tenerse en cuenta al medir superficies de objetos facetados.

6.9 Exportación 3D de Mallas para Fabricación Aditiva e Investigación (STL y OBJ)

Las superficies generadas por Marching Cubes pueden exportarse directamente desde la base del Asistente de Superficies en dos estándares de la industria computacional:

• Binary STL (Stereolithography): Formato estándar de la industria de manufactura aditiva y bio-impresión 3D.
  • Estructura Binaria: Cabecera de 80 bytes (identificador de software y versión), seguido de un entero sin signo de 32 bits (uint32) con el recuento total de triángulos $N_{\text{tri}}$. A continuación, se suceden bloques contiguos de 50 bytes por cada faceta triangular: 12 bytes para el vector normal unitario $\mathbf{n} = (n_x, n_y, n_z)$ en formato IEEE 754 float32 Little-Endian, 36 bytes para las coordenadas de los tres vértices $\mathbf{v}_1, \mathbf{v}_2, \mathbf{v}_3$ en float32, y 2 bytes de espaciado de atributos.
  • Compatibilidad con Slicers 3D: El archivo generado es 100 % estanco (watertight manifold) y se importa directamente en PrusaSlicer, Bambu Studio, Ultimaker Cura u OrcaSlicer sin errores de geometría no-múltiple.
  • Escala de Impresión: Los vértices se encuentran en coordenadas micrométricas reales ($\mu m$). Al abrir el archivo en el laminador, el software interpreta cada micrómetro como un milímetro ($1\,\mu\text{m} = 1\,\text{mm}$), lo que produce un macro-modelo físico magnificado exactamente a escala 1.000:1, ideal para docencia, divulgación médica y análisis táctil de patologías celulares.
• Wavefront OBJ: Estándar universal de intercambio para computación gráfica, animación biomédica y modelado CAD.
  • Estructura Geométrica: Define sentencias de vértices geométricos v x y z calibrados en micrómetros, normales de superficie por vértice vn nx ny nz calculadas a partir del gradiente tridimensional para sombreado suave continuo (Phong shading), y topología poligonal de caras triangulares f v1//vn1 v2//vn2 v3//vn3.
  • Interoperabilidad: Totalmente compatible con Blender (motores Cycles y Eevee), Autodesk Maya, 3ds Max, CloudCompare, MeshLab y Bitplane Imaris para composición de figuras de alto impacto visual y secuencias cinematográficas.

6.10 Ajuste de Cobertura en Tiempo Real: Búsqueda $O(1)$ sobre la CDF

Para permitir que el usuario seleccione visualmente la cobertura porcentual de superficie ($P \in [0, 100]\%$) sin experimentar bloqueos en la interfaz, el motor precalcula la Función de Distribución Acumulada (CDF) del volumen:

donde $H[i]$ es el histograma de frecuencias discretas de 16 bits. Cuando el usuario desplaza el deslizador, el umbral de intensidad exacto se recupera mediante una búsqueda dicotómica (búsqueda binaria logarítmica) sobre los 65.536 escalones en sólo 16 operaciones ($< 0{,}02$ milisegundos). Esto desacopla completamente la interacción de la interfaz de la carga de cálculo volumétrico, garantizando una latencia nula.

Detección Sub-Vóxel de Puntos y Vesículas (Spots)

El análisis de estructuras subcelulares de tamaño próximo o inferior al límite de difracción —vesículas sinápticas, endosomas, partículas virales, gránulos ribonucleoproteicos— se realiza mediante detección de blobs sensible a la escala.

7.1 Detección por diferencia de gaussianas

1. Filtrado pasa-banda: convolución con un núcleo de Diferencia de Gaussianas (DoG, aproximación estándar al Laplaciano de Gaussiana; Marr & Hildreth, 1980) con razón de escalas $k = 1{,}6$. La escala se ajusta al radio esperado del objeto mediante $\sigma = r / \sqrt{3}$, que es donde un blob maximiza su respuesta en 3D, por separado en cada eje: $\sigma_{xy} = r_{xy}/\sqrt{3}$ y $\sigma_z = r_z/\sqrt{3}$, cada una en los vóxeles de su eje, con $r_z = a \cdot r_{xy}$ y $a$ el alargamiento axial del asistente (2 por defecto). Las convoluciones son separables (tres pasadas 1D), lo que reduce el coste de $O(nk^3)$ a $O(nk)$.
2. Máximos locales 3D: vóxeles cuya respuesta DoG supera la de sus 26 vecinos. El desempate en mesetas es determinista, de modo que una cresta plana no genera múltiples máximos coincidentes.
3. Refinamiento sub-vóxel: ajuste parabólico de la respuesta DoG a lo largo de cada eje. Sobre phantoms gaussianos de centro conocido, el error de localización es de 0,002 $\mu m$ (≈ 1,3 % de un vóxel).

7.1 bis Puntos alargados en Z: el radio axial

La función de dispersión de punto (PSF) de un microscopio es más larga en Z que en XY: en un confocal con objetivo de inmersión, de dos a tres veces; en campo amplio, más. Por eso el asistente pide, además del radio XY, el alargamiento axial ($r_z / r_{xy}$). Hasta el Build 018900 el filtro usaba en Z el mismo σ en vóxeles que en XY, así que su tamaño físico dependía del paso Z: con $\Delta z \approx 3\,\Delta xy$ imitaba la PSF por casualidad, y con pasos de 0,5–1 µm fundía puntos próximos en Z.

Validación. En un banco de 12 escenas con verdad conocida (220 puntos cada una, PSF gaussiana con alargamiento axial de 2,1, 2,9 y 4,2; pasos Z de 0,1, 0,3, 0,5 y 1 µm; ruido de Poisson y pares de puntos próximos), el modelo por ejes sube el F1 medio de 0,978 a 0,991 (el peor caso, de 0,892 a 0,935), con error de localización de 7 nm en XY y 51 nm en Z, sin empeorar en ninguna escena de Z fino. Cuando el paso Z es más grueso que el σ axial del modelo, el centro en Z se ajusta con una gaussiana de tres planos (parábola sobre el logaritmo), que en esos casos lo sitúa mejor que la parábola sobre la respuesta DoG.

7.2 Corrección de fondo local

La intensidad de cada spot no es el valor crudo del vóxel máximo. Se mide como la intensidad interpolada trilinealmente en el centro ajustado, menos un fondo local: la mediana de una corteza elipsoidal comprendida entre 2 y 3 radios alrededor del objeto (radio XY en XY y radio Z en Z; en 2D, una corona). Entre 1 y 2 radios, como se hacía antes, la corteza caía dentro de la cola del propio punto y el fondo salía alto: en el banco anterior, 34 niveles de media y hasta 88 con Z fino; ahora, 2,5. La mediana, además, no se deja arrastrar por un punto vecino que caiga en la corteza.

El efecto es directamente comprobable: sobre el mismo objeto sintético colocado sobre fondos de 10 y 90 cuentas, la intensidad corregida es idéntica. Sin corrección, seguiría al fondo y estaría midiendo la iluminación en lugar de la sonda. Se reportan además intensidad de pico, fondo estimado y relación señal/ruido.

7.3 Magnitudes medidas frente a magnitudes modeladas

Morfometría de Filamentos, Neuritas y Redes Vasculares (Filaments)

El módulo de Filaments extrae la geometría de prolongaciones tubulares —árboles dendríticos, axones, redes capilares— directamente de los datos de imagen, y produce las métricas que la literatura de neurociencia reporta habitualmente.

8.1 Extracción de centerlines geodésicas

El procedimiento no se basa en adelgazamiento homotópico (thinning), sino en el trazado de centerlines geodésicas desde el soma, que es la aproximación empleada por los trazadores de neuritas de referencia (familia APP/APP2, Peng et al.):

1. Umbralización del canal seleccionado y transformada de distancia con pesos físicos anisótropos, de modo que el radio local queda expresado en $\mu m$ y no en vóxeles.
2. Origen automático: el máximo global de la transformada de distancia, es decir, el punto más grueso de la estructura, que en una neurona corresponde al soma.
3. Distancia geodésica centrada: se propaga la distancia a través de la estructura, penalizando cada paso por su alejamiento del eje medial. Sin esa penalización, el camino más corto se pega a la pared interior de cada curva y no es una línea central.
4. Trazado iterativo del punto más lejano: el vóxel geodésicamente más distante es una punta; su centerline es el camino de descenso hasta el soma. Cada trayecto reclama un tubo de influencia a su alrededor y la siguiente punta es el punto más lejano aún no reclamado.

La longitud resulta de sumar pasos físicos reales a través de vóxeles reales, de modo que es correcta por construcción, también en trayectos diagonales.

8.2 Métricas de arborización

• Longitud total trazada ($\mu m$), suma de todos los trayectos.
• Número de prolongaciones y puntos de bifurcación.
• Trayecto más largo ($\mu m$): el eje principal de la arborización.
• Radio medio ($\mu m$), tomado de la transformada de distancia a lo largo de cada centerline; es una magnitud medida, no un parámetro de renderizado.
• Fracción conectada: proporción de la estructura umbralizada que resulta alcanzable desde el soma.

8.3 Análisis de Sholl

El análisis de Sholl (Sholl, 1953) cuantifica la complejidad de la arborización contando cuántas ramas distintas cruzan esferas concéntricas de radio creciente centradas en el soma. El recuento se obtiene como número de componentes conexas de la estructura dentro de cada cascarón, que es la definición estándar, y se calcula directamente sobre la máscara umbralizada, no sobre el esqueleto —lo que lo hace independiente de los detalles del trazado.

Se reportan los tres descriptores con los que suele resumirse un perfil de Sholl:

• Pico de intersecciones ($N_{\max}$): máximo del perfil.
• Radio crítico ($r_c$): distancia al soma donde se alcanza ese máximo.
• Radio envolvente ($r_e$): distancia del cruce más lejano; delimita la extensión de la arborización.

El perfil completo se representa en la interfaz y se exporta íntegro en el registro de procedencia, de modo que puede replicarse la figura en R o Python sin volver a ejecutar el análisis. Sobre un phantom de seis neuritas radiales, el pico medido es exactamente 6 intersecciones.

Biofísica de Colocalización de Fluorescencia (Coloc)

La colocalización cuantifica en qué medida dos especies fluorescentes ocupan los mismos vóxeles. Es, con diferencia, el análisis de imagen que más objeciones recibe en revisión por pares, y por ello el módulo reporta de forma conjunta el juego de coeficientes que un revisor espera ver.

9.1 Coeficiente de correlación de Pearson

$r$ mide covariación de intensidades y toma valores en $[-1, +1]$. Se calcula sobre la ROI completa, sin máscara de intensidad, que es la convención bajo la que el coeficiente fue definido. La política de máscara aplicada se declara explícitamente en el resultado y en el párrafo de Métodos.

9.2 Umbral automático de Costes

Los umbrales fijados a ojo son la principal fuente de irreproducibilidad en colocalización. El procedimiento de Costes et al. (2004) los determina a partir de los propios datos:

1. Se ajusta una regresión ortogonal (mínimos cuadrados totales) $B = a\,A + b$. Se emplea regresión ortogonal y no ordinaria porque ambos canales portan ruido de medida.
2. Se hace descender el umbral a lo largo de la recta de regresión hasta que la población por debajo del umbral deja de estar correlacionada ($r \le 0$).
3. Lo que queda por encima es, por construcción, la población correlacionada; los umbrales resultantes $(\tau_A, \tau_B)$ separan señal de fondo sin intervención del operador.

9.3 Coeficientes de Manders

$M_1$ es la fracción de la intensidad total de $A$ que reside en vóxeles donde $B$ supera su umbral, y recíprocamente $M_2$. A diferencia de $r$, son independientes entre sí y no se ven afectados por diferencias de intensidad absoluta entre canales, lo que los hace preferibles cuando las eficiencias de marcaje difieren (Manders et al., 1993).

9.4 Coeficientes complementarios

• ICQ de Li (Li et al., 2004): fracción de vóxeles en que ambas intensidades se desvían de su media en el mismo sentido, desplazada a $[-0{,}5, +0{,}5]$. Valores próximos a $+0{,}5$ indican dependencia; próximos a $0$, independencia; negativos, exclusión.
• $\rho$ de Spearman: correlación de rangos. Es robusta ante respuestas no lineales del detector: sobre una relación monótona pero no lineal, $\rho = 1{,}000$ mientras que $r = 0{,}916$. Reportar ambos permite distinguir una relación real de una no linealidad instrumental.

9.4 bis Aceleración de Spearman en Tiempo Lineal $O(N)$

En biofísica de fluorescencia, el coeficiente de correlación de rangos de Spearman se define formalmente como:

donde $d_i = \text{rg}(A_i) - \text{rg}(B_i)$ representa la diferencia de rangos de intensidad entre los canales $A$ y $B$ para el vóxel $i$.

El problema de complejidad $O(N \log N)$: Tradicionalmente, asignar el rango de cada vóxel exige ordenar los datos mediante algoritmos basados en comparaciones (como quicksort o mergesort). Para una pila confocal de $10^7$ vóxeles (adquisición estándar de $1024 \times 1024 \times 10$ cortes), ordenar dos canales consumía más de 35 segundos en JavaScript y requería gigabytes de memoria transitoria, congelando por completo la interfaz del usuario.

Solución por Histograma Acumulativo Discreto $O(N)$: Dado que los detectores de microscopía digitalizan la señal a profundidades discretas de 8 a 16 bits (rango $[0, 65535]$), MTZ² Lite implementa un algoritmo de asignación de rangos basado en ordenación por conteo e histograma acumulativo:

1. Se construye el histograma de frecuencias discretas $H[v]$ de cada canal en una única pasada lineal $O(N)$.
2. A partir de $H[v]$, el rango fraccionario promedio asignado a todos los vóxeles que empatan en la intensidad $v$ se deriva analíticamente mediante sumas de prefijos acumuladas en tiempo $O(K)$, donde $K = 65536 \ll N$:
   $$ \text{Rango}(v) = 1 + \left( \sum_{u < v} H[u] \right) + \frac{H[v] - 1}{2} $$
3. En una segunda pasada lineal $O(N)$, se recupera instantáneamente el rango precomputado de cada vóxel en una tabla directa y se acumula la suma de diferencias al cuadrado $\sum d_i^2$.

Rendimiento Medido: El tiempo de ejecución se reduce de 35.000 ms a menos de 20 ms (aceleración superior a 1.700×), produciendo un valor matemáticamente idéntico y permitiendo recalcular la colocalización en tiempo real conforme el usuario ajusta regiones de interés o umbrales.

9.5 Significación estadística por aleatorización de bloques

Un $r$ alto no demuestra colocalización: dos señales que simplemente llenan el mismo compartimento correlacionan sin interactuar. La prueba de aleatorización de Costes permuta el canal $B$ en bloques del tamaño de la PSF —lo que destruye la colocalización pero preserva la textura local— y compara el $r$ observado con la distribución de $r$ aleatorizados.

El generador pseudoaleatorio es determinista: la misma entrada produce siempre el mismo p-valor. Sin esa garantía, el análisis no sería reproducible y el p-valor no sería citable.

Dinámica 4D, Seguimiento de Objetos y Cinética Celular

Una serie temporal no es una pila de imágenes que se reproducen: es un experimento sobre movimiento. Reproducir fotogramas no mide nada. Lo que convierte una secuencia 4D en datos cuantitativos es vincular cada objeto consigo mismo a lo largo del tiempo, y de ahí derivar velocidad, direccionalidad y régimen de difusión.

10.0 Cómo llegar y cómo usarlo

1. Cargue un espécimen con varios puntos temporales: Mitosis, Red Microvascular o Fagocitosis en el desplegable de la barra superior. Con un espécimen de un solo fotograma el módulo avisará de que no hay nada que seguir.
2. En el panel izquierdo, abra la pestaña 🌳 Surpass Tree.
3. Haga clic en el elemento ◯ Trayectorias 4D del árbol. La aplicación cambia sola a la pestaña ⚙️ Asistentes y muestra ahí el asistente 🕑 Seguimiento 4D de Objetos.
4. Elija el canal que contiene los objetos móviles y declare el intervalo entre fotogramas en segundos — es el dato que convierte desplazamientos en velocidades, y la aplicación no puede deducirlo del archivo.
5. Opcionalmente fije una velocidad máxima plausible; si la deja en auto, el radio de enlace se estima de los propios datos.
6. Pulse 🕑 Seguir objetos en el tiempo. Los spots se detectan en cada fotograma con los parámetros del asistente de Spots y se enlazan a continuación.

El resultado aparece bajo el botón: recuento de trayectorias, velocidad media, rectitud, difusión aparente y la gráfica de MSD. En el visor 3D las trayectorias se dibujan como polilíneas, y la casilla del árbol las muestra u oculta.

10.1 Vinculación por asignación global

El enlace entre fotogramas consecutivos se resuelve como un problema de asignación óptima mediante el algoritmo húngaro, no por vecino más próximo.

10.2 Nacimientos, muertes y huecos

La matriz de coste se amplía siguiendo el esquema de Jaqaman et al. (2008), de modo que «no enlazar» compite como una opción con precio finito: cuando forzar un salto resulta menos plausible que aceptar una desaparición y una aparición, el algoritmo elige lo segundo. Así se manejan de forma natural los objetos que entran y salen del campo.

El parámetro huecos tolerados permite que un objeto no detectado durante uno o dos fotogramas no rompa su trayectoria. El enlace se realiza contra las colas de las trayectorias abiertas, no contra las detecciones del fotograma anterior, y el radio de búsqueda crece proporcionalmente al hueco. Sin este mecanismo, un parpadeo de detección parte la trayectoria en dos y toda duración reportada queda subestimada.

10.3 Radio de enlace

Si declara una velocidad máxima plausible, el radio es $v_{\max} \cdot \Delta t$. Si la deja en automático, se estima como tres veces la mediana de las distancias al vecino más próximo entre fotogramas consecutivos. Se usa la mediana y no la media para que unos pocos objetos rápidos no inflen el radio hasta que todo enlace con todo. El valor aplicado y su procedencia constan en el informe, en el CSV y en el párrafo de Métodos.

10.4 Magnitudes derivadas

• Velocidad instantánea y media ($\mu m/s$), con su desviación típica.
• Recorrido (longitud del camino) frente a desplazamiento neto (distancia entre el primer y el último punto).
• Rectitud $= \dfrac{\text{desplazamiento neto}}{\text{recorrido}}$, acotada en $(0, 1]$. Es la medida de direccionalidad más reportada en trabajos de migración: próxima a 1 indica movimiento dirigido; próxima a 0, deambulación confinada.
• Desplazamiento cuadrático medio (MSD) frente al retardo $\tau$, promediado sobre todas las trayectorias.
• Coeficiente de difusión aparente, de la pendiente inicial del MSD según $\langle r^2 \rangle = 6 D \tau$ en tres dimensiones.

10.5 Representación y exportación

Cada trayectoria se dibuja en el espacio 3D como una polilínea coloreada según su velocidad media, sobre una rampa perceptualmente ordenada —no rojo-verde, que en torno al 8 % de los varones no distingue—. El CSV exporta cuatro bloques: resumen de población, una fila por trayectoria, la curva de MSD completa, y todos los puntos con su fotograma, tiempo y coordenadas, listos para reanalizar en R o Python.

10.6 Descomposición en Componentes Conexas Bipartitas del Algoritmo Húngaro

El problema de asignación lineal óptima entre las detecciones del fotograma $t$ y las colas de trayectorias en $t+1$ busca minimizar el coste euclídeo total:

El algoritmo clásico de Kuhn-Munkres (húngaro) exhibe una complejidad computacional cúbica $O(N^3)$, donde $N$ es el número total de candidatos. Para time-lapses celulares densos con cientos o miles de spots, evaluar la matriz global requería más de 8.500 ms por fotograma, bloqueando la interfaz.

Optimización Biofísica por Ventana Espacial $R_{\max}$ y Partición Bipartita: En microscopía biológica, la velocidad física de desplazamiento celular o vesicular está acotada por una cota máxima finita $v_{\max}$, lo que define un radio de búsqueda estricto:

El motor de MTZ² Lite estructura las asignaciones construyendo un grafo bipartito disperso donde sólo se crean aristas entre candidatos cuya distancia euclídea cumple $d(i, j) \le R_{\max}$. Mediante un recorrido en anchura (BFS), el grafo se descompone en sus componentes conexas independientes disjuntas.

Cada componente conexa (cuyo tamaño suele ser muy pequeño, $k \ll N$) se resuelve de forma totalmente aislada con el algoritmo húngaro. La complejidad total pasa de ser cúbica global a lineal en el número de subgrupos: $O\left(\sum k_i^3\right) \ll O(N^3)$.

Rendimiento: El tiempo de resolución cae de 8.500 ms a sólo 2 ms por par de fotogramas (una aceleración de más de 4.000×), permitiendo procesar series temporales 4D continuas en milisegundos.

10.7 Eliminación de Pausas de GC: Pool Estático en la Transformada de Distancia (EDT)

Durante el desaglomerado celular en 3D (Watershed), la transformada de distancia euclídea exacta (algoritmo de envolvente parabólica de Felzenszwalb-Huttenlocher) calcula distancias a lo largo de líneas 1D en los tres ejes espaciales.

En implementaciones habituales, los vectores auxiliares para índices de parábolas e intersecciones se reservaban y destruían en cada iteración de línea. Para un volumen de $512 \times 512 \times 64$ cortes, esto generaba más de 540.000 asignaciones transitorias de TypedArray, provocando paradas frecuentes y prolongadas del recolector de basura (Garbage Collection pauses) del motor V8.

MTZ² Lite implementa un pool de memoria estática preasignada con buffers reutilizables dimensionados al eje máximo del espécimen. Las asignaciones de memoria durante la transformada caen a cero, erradicando los parones de GC y reduciendo el tiempo de cálculo de Watershed en un 70 %.

10.8 Dónde leer las velocidades

Las cifras aparecen en dos sitios, y conviene no confundirlos:

• Resumen de población, bajo el botón del asistente: velocidad media ± desviación típica de todas las trayectorias, rectitud media, duración media, difusión aparente y radio de enlace aplicado.
• Tabla por trayectoria, en el panel derecho, pestaña 📏 Medidas: una fila por objeto seguido, con su velocidad media ± DE, velocidad máxima, recorrido, desplazamiento neto, rectitud, número de fotogramas y duración. Ordenada de más rápida a más lenta.

Las filas sombreadas en ámbar son trayectorias truncadas por el inicio o el final de la adquisición. Su velocidad sí es una medida válida; su duración no lo es, porque el objeto ya se movía antes de empezar a grabar o siguió después.

Cortes Ortogonales Flotantes y Metrología 3D Euclidiana

El modo Ortho Slicer presenta las tres proyecciones canónicas (XY axial, XZ coronal, YZ sagital) del volumen calibrado, navegables de forma independiente. Es el complemento del espacio Surpass: lo que en la vista 3D es una superficie renderizada, aquí es el dato original plano a plano.

11.1 Regla 3D: medición punto a punto

La Regla 3D (botón 📏 de la barra flotante) mide la distancia euclidiana entre dos puntos del espacio calibrado:

El resultado se expresa en $\mu m$ reales según la calibración de vóxel del espécimen. Procedimiento:

1. Active la regla con 📏. El cursor pasa a cruz y la rotación de cámara queda desactivada mientras dure la medición, para que un clic con arrastre mínimo no gire la vista en lugar de marcar.
2. Haga clic en el primer punto y después en el segundo. Aparece un marcador cian en cada uno y una línea discontinua entre ambos.
3. Al segundo clic la medida queda registrada y el contador se reinicia: los dos clics siguientes constituyen una medición nueva, no una polilínea.
4. El historial se acumula en la pestaña Mediciones del panel derecho, con las tres coordenadas de cada extremo.
5. Pulsar 📏 de nuevo desactiva la regla y borra los marcadores de la escena; las filas registradas permanecen.

11.2 Dónde cae exactamente el punto

Éste es el aspecto metodológicamente delicado de cualquier regla 3D, y conviene entenderlo antes de publicar una distancia. La aplicación resuelve el punto en dos etapas:

1. Geometría sólida primero. El rayo se traza contra las isosuperficies, spots y filamentos visibles. Si impacta en alguno, el punto es la intersección exacta con esa geometría, y la medición es independiente de los ajustes de visualización.
2. Marcha por el volumen si no hay geometría. Si no se alcanza ninguna superficie, el rayo avanza a través de los datos de vóxeles y se detiene en el primer vóxel cuya intensidad supera el umbral de visualización del canal. Es decir, en la primera estructura que usted realmente ve en esa línea de visión.
3. Si no hay nada en esa dirección, no se coloca ningún punto y la aplicación lo indica, en lugar de inventar una coordenada.

11.4 Barras de escala

Ambas vistas muestran una barra de escala, y ambas se calculan de la geometría real de visualización:

• Vista 3D: los micrómetros por píxel dependen de la distancia de la cámara al punto observado, según $h = 2 d \tan(\theta/2)$ para el campo de visión $\theta$. Por eso la barra cambia al hacer zoom: acercar la cámara reduce $d$ y con ello cuántos µm abarca un píxel.
• Cortes ortogonales: la escala sale directamente de la calibración — número de vóxeles por tamaño de vóxel— y por tanto de una imagen a otra cambia si cambia la calibración.

La longitud se redondea siempre a 1, 2 o 5 por una potencia de diez, y la unidad se adapta: nanómetros por debajo de 1 µm, milímetros por encima de 1000.

11.3 Exportación

Las mediciones se incluyen en el CSV (Ctrl+E) con las tres coordenadas de cada extremo, la superficie sobre la que se tomaron y su marca temporal ISO 8601; se guardan y restauran con la sesión; y se resumen en el párrafo de Métodos con media y rango.

11.5 Vistas canónicas 3D y análisis ortográfico en pantalla completa (Modo Maximizado)

En análisis bio-óptico confocal, la rotación libre en perspectiva tridimensional permite explorar la topología celular global, pero impide una comparación cuantitativa estandarizada entre experimentos al introducir variaciones arbitrarias en los ángulos de acimut ($\phi$) y elevación ($\theta$). Para resolver esto, el modal flotante de herramientas del modo maximizado (M o botón de pantalla completa) expone las cuatro proyecciones canónicas fundamentales:

Al seleccionar cualquiera de estas vistas, el controlador calcula la distancia de encuadre $d$ a partir de la diagonal de la caja contenedora del espécimen ($D = \sqrt{\Delta x^2 + \Delta y^2 + \Delta z^2}$), garantizando que el espécimen completo queda enfocado sin recortes ni deformación angular.

11.6 Sistema modular de paneles dinámicos y ergonomía visual (PanelManager)

El procesamiento cuantitativo de pilas confocales de alta resolución impone una elevada carga cognitiva sobre el investigador. Los visores que encierran el lienzo 3D entre paneles fijos fuerzan al usuario a trabajar en una fracción reducida de su monitor. MTZ² Lite incorpora el sistema dinámico PanelManager:

• Desacoplamiento a ventanas flotantes (❐): Cada panel (Surpass Tree / Canales a la izquierda, Estadísticas / Coloc a la derecha, y la Línea de Tiempo 4D inferior) puede desacoplarse de la retícula fija. El panel se transforma en una ventana flotante con efecto glassmorphism (desenfoque de fondo por GPU), que puede desplazarse libremente arrastrándola desde su asidero (⋮⋮) y posicionarse en monitores secundarios en estaciones de trabajo de laboratorio con doble pantalla.
• Redimensionado micrométrico adaptativo: Las manijas divisorias permiten ajustar la anchura de los paneles laterales y la altura de la línea de tiempo. Los paneles flotantes incorporan manijas angulares (⤡) para redimensionamiento bidimensional suave.
• Cierre individual (✕) y pestañas retráctiles de borde: Al cerrar un panel, el lienzo WebGL Three.js se expande inmediatamente para aprovechar el 100 % del espacio disponible, recalculando las matrices de proyección sin interrupciones. En el borde correspondiente aparece una pestaña retráctil (🌳 Izquierda, 📊 Derecha, ⏱️ Tiempo) que permite reabrir el panel con un solo clic.
• Atajos de teclado rápidos de navegación ergonómica:
  • Alt+1: Alternar visibilidad del Panel Izquierdo (Surpass / Canales / Asistentes).
  • Alt+2: Alternar visibilidad del Panel Derecho (Estadísticas / Coloc / Medidas / Objetos).
  • Alt+3: Alternar visibilidad de la Línea de Tiempo 4D.
  • Alt+4: Alternar visibilidad de la Barra Flotante de Herramientas 3D.
  • Alt+5: Plegar / Desplegar Barra Superior de Menús.
  • Alt+0: Restablecer instantáneamente la disposición canónica predeterminada.
• Persistencia de la disposición (Layout Persistence): El estado del espacio de trabajo (visibilidad, coordenadas $x, y$, anchuras y estado de flotación de cada panel) se sincroniza continuamente en localStorage bajo la clave mtz_workspace_layout_v1. Al reiniciar el navegador, el investigador encuentra su entorno exactamente en la configuración que optimizó.

11.7 Identificación y metadatos de muestras y series en tiempo real (MUESTRA:)

En microscopía cuantitativa, una de las mayores causas de error metodológico es la confusión de especímenes o la no declaración del número de cortes axiales que componen un volumen. La sección MUESTRA: de la cabecera actúa como un testigo inmutable del conjunto de datos visible en el motor:

• Detección y agrupamiento automático de series multicorte ($Z$-stacks): Al importar múltiples cortes numerados (ej. HeLa_mito_Z001.tif ... HeLa_mito_Z045.tif), el algoritmo de prefijo extrae la raíz biológica común y declara en pantalla 📁 HeLa_mito (45 cortes), evitando que el usuario confunda un corte individual con la serie tridimensional completa.
• Diferenciación estricta 2D vs 3D física: Al cargar una imagen 2D aislada, el rótulo declara explícitamente 📷 nombre (2D extruida). Esto alerta al investigador de que el eje axial es un artefacto de decaimiento sintético y previene la publicación de volúmenes o profundidades ficticias.
• Punto de estado LED neón: Un indicador circular luminoso muestra en tiempo real si el visor contiene un espécimen físico activo (● Verde esmeralda neón) o si se encuentra en estado vacío tras pulsar cerrar imagen (○ Gris inactivo).
• Tooltip de procedencia y calibración micrométrica: Al posar el cursor sobre el bloque, se despliega una ficha técnica con las dimensiones exactas ($N_x \times N_y \times N_z$ vóxeles), número de canales fluorocromáticos, espaciado físico ($dx \times dy \times dz$ en $\mu\text{m}$) y origen de la calibración (declarada por el microscopio, introducida por el usuario o valor asumido por defecto).

Procedencia del Análisis, Métodos Autogenerados y Principios FAIR

La mayor fuente de irreproducibilidad en imagen cuantitativa no es un algoritmo equivocado: es que tres meses después nadie recuerda qué umbral se usó, sobre qué versión y contra qué archivo. El panel Reproducibilidad registra esa información mientras el análisis ocurre, y redacta la sección de Métodos a partir del registro y no de la memoria.

12.0 Saber qué versión hay en producción

Junto al logotipo, arriba a la izquierda, aparece el número de build: Build 018778. Es correlativo y se incrementa cada vez que se prepara una entrega, de modo que identifica sin ambigüedad qué está desplegado.

El build queda registrado en la procedencia y aparece en el párrafo de Métodos, porque dos entregas distintas comparten el mismo número de versión semántica y sólo el build distingue de cuál salió un resultado.

Para quien prepare la entrega: npm run build incrementa el número y vuelve a sellar; npm run build:check avisa si hay cambios sin sellar.

12.1 Registro de procedencia

Cada medida queda acompañada de las condiciones exactas en que se produjo:

• Identidad del dato: nombre, dimensiones, profundidad de bits y huella SHA-256 de los vóxeles. Dos análisis que citen la misma huella se ejecutaron sobre los mismos bytes; es la única forma de demostrarlo a posteriori.
• Calibración y su origen: valor de vóxel, si procede de metadatos OME, de introducción manual o de un valor asumido, y el factor de remuestreo aplicado.
• Parámetros de cada módulo con marca temporal ISO 8601: umbrales, canales, radios esperados, método de umbralización de coloc, número de aleatorizaciones.
• Versión del software y del algoritmo empleado.

El registro se exporta en JSON, adecuado como material suplementario o para el cuaderno de laboratorio electrónico.

12.2 Párrafo de Métodos generado

La pestaña Párrafo de Métodos redacta el texto en inglés científico, con sus citas bibliográficas, a partir de lo que realmente se ejecutó. Cada número del texto salió del análisis; ninguno está plantillado. Se incluyen automáticamente las referencias pertinentes (Lorensen & Cline 1987; Marr & Hildreth 1980; Manders et al. 1993; Costes et al. 2004; Li et al. 2004; Bolte & Cordelières 2006; Sholl 1953) según los módulos utilizados.

El texto incorpora además las advertencias que correspondan: calibración asumida, objetos en contacto con el borde, eje Z sintético, o arborización fragmentada.

12.3 Sesiones guardables y compartibles

Una sesión conserva umbrales, canales, ajustes de visualización, objetos detectados, mediciones y ángulo de cámara. Puede guardarse como archivo .mtz2.json o convertirse en un enlace reproducible.

Utilidades: discutir figuras entre coautores, adjuntar el enlace como material suplementario para que un revisor reproduzca el análisis, y docencia.

12.4 Procesamiento por lotes

La pestaña Lote aplica los mismos parámetros a un conjunto de muestras y devuelve una tabla con una fila por muestra. Las series numeradas se agrupan automáticamente por prefijo común, de modo que celula01_Z001.tif … celula01_Z040.tif constituye una sola muestra.

El CSV exportado encabeza la tabla con los parámetros aplicados. Una tabla de resultados que no declara sus condiciones no puede ser verificada por nadie más adelante, incluido su autor. Cada fila arrastra además sus propios avisos: objetos recortados por el borde, calibración asumida, arborización fragmentada.

12.5 Exportación y estadística descriptiva

El CSV de sesión incluye metadatos de muestra, métricas globales, tabla completa de spots con coordenadas en $\mu m$, y segmentos de filamentos. Es directamente importable en R (readr::read_csv), Python (pandas.read_csv), GraphPad Prism y MATLAB.

El panel de estadísticas reporta $n$, media $\pm$ desviación típica, intervalo de confianza al 95 % de la media, mediana y rango. Una media sin su dispersión y sin su $n$ no es un estadístico reportable. El IC se calcula con la aproximación normal ($1{,}96 \times \text{EEM}$), que subestima el intervalo por debajo de $n = 30$; por eso el $n$ se muestra siempre junto a él.

12.6 Catálogo de objetos: crear, editar y conservar

La pestaña 🗂 Objetos, en el panel derecho, reúne en una sola lista todo lo que hay en la escena: lo que han detectado los asistentes y lo que usted haya creado a mano. Cada objeto se puede renombrar, recolorear, mover, redimensionar, ocultar, duplicar y borrar.

+ Esfera crea uno en el centro de la vista actual; después se ajustan las coordenadas y el radio en Propiedades. Las detecciones se pueden volver a lanzar sin miedo: al reejecutar un asistente se sustituyen únicamente los objetos que ese asistente había generado y que usted no haya tocado. Sus objetos manuales, y cualquier objeto automático que haya editado, se conservan.

Qué se mide y qué se declara

Un objeto colocado a mano tiene un volumen, un radio y una intensidad, igual que uno detectado. Si esas cifras convivieran sin distintivo en la misma tabla, la figura acabaría publicando como hallazgo del instrumento un número que eligió el operador. Por eso el catálogo separa tres cosas y no las mezcla nunca:

• Declarado — lo que usted afirma: posición, radio, nombre. Es una entrada, no un hallazgo.
• Medido — lo que se lee de los vóxeles en esa región: intensidad media, pico, fondo y SNR. Una esfera colocada a mano sigue estando sobre datos reales, y la intensidad dentro de ella sí es una medida: de una región que eligió usted.
• Modelo — lo que se deduce de la geometría declarada bajo un supuesto: el volumen de una esfera del radio declarado. Nunca una medida.

El panel de propiedades etiqueta cada cifra con su procedencia, y el objeto guarda un historial de qué se cambió y cuándo. Editar un objeto detectado lo reclasifica como derivado · editado de forma permanente: deja de ser una detección automática. Ocultarlo, en cambio, no cuenta como edición, porque es una preferencia de vista y no altera el dato.

Esta distinción sobrevive fuera de la aplicación. El CSV incluye un bloque de catálogo con una columna de origen por cada magnitud, y el párrafo de Métodos declara cuántos objetos se crearon o editaron a mano sobre el total. Un recuento curado no se puede presentar como automático.

Trazar contornos a mano

✏️ Trazar contorno permite dibujar la forma real de una estructura cuando ningún radio la describe: un soma, un nido tumoral, un vaso en sección. Se dibuja sobre los cortes ortogonales manteniendo pulsado el ratón; el contorno se cierra solo al soltar, de modo que no hace falta volver exactamente al punto de partida. Cambie de corte y vuelva a trazar la misma estructura para medir su volumen a lo largo de la pila, y pulse Crear región al terminar.

Se traza sobre los cortes y no sobre la vista 3D por una razón de fondo: en un corte el operador ve las intensidades de vóxel que está juzgando, y un clic corresponde a un vóxel inequívoco. En una vista tridimensional en perspectiva un clic es un rayo, y todos los puntos a lo largo de él son igual de compatibles con dónde quiso dibujar el usuario — el contorno, y por tanto el área, serían una conjetura.

Una región trazada informa de cifras mejor fundadas que una esfera ajustada, porque casi nada se supone:

• El área es la integral exacta del polígono dibujado (fórmula del cordón), escalada por el tamaño de vóxel del plano. No es un modelo: es el área de la forma que se trazó.
• El volumen es la suma de esas áreas por el grosor de corte: una integración real sobre los cortes dibujados.
• La intensidad se mide sobre los vóxeles que el contorno encierra.

Lo único que no se puede afirmar es que algo encontrara el límite: lo dibujó el operador, y así consta.

Cortes sin trazar. Si traza el corte 5 y el 9 pero no los intermedios, la aplicación rellena el hueco con la regla del trapecio y lo contabiliza en un campo aparte: «volumen trazado» y «volumen interpolado» nunca se suman en silencio. El panel avisa de cuántos cortes faltan, y el CSV lleva ambas columnas más el recuento de cortes sin trazar. Un volumen interpolado no es un volumen medido.

El trazo a mano alzada se simplifica con el algoritmo de Ramer-Douglas-Peucker: cientos de puntos por segundo no hacen el contorno más exacto, sólo más pesado. La tolerancia está fijada de modo que el área no varíe apreciablemente; en la calibración, un círculo de 500 vértices se reduce a 52 con una diferencia de área del 0,33 %.

Malla reconstruida

Con la casilla Malla reconstruida, activa por defecto en las regiones, la aplicación cierra una superficie a través de los contornos trazados: útil para una figura, y exportable. Los contornos se remuestrean a un número fijo de vértices equiespaciados y se alinean entre sí antes de unirlos, de modo que la banda no salga retorcida porque los dos trazos empezaran en puntos distintos.

Ninguna parte de esa superficie fue delineada. El operador trazó curvas sobre unos pocos cortes; la piel tendida entre ellas no la dibujó nadie. Por eso la superficie se declara siempre como reconstruida, nunca como medida, y se desglosa según cuánto tuvo que estirarse:

• Entre cortes contiguos — el salto más corto posible. Se dibuja sólida.
• Salvando cortes sin trazar — una conjetura más larga, sobre una forma que el usuario no llegó a delinear. Se dibuja translúcida y en malla de alambre.
• Tapas de los extremos — la suposición de que la estructura acaba plana donde acabó el trazado. Más tenues todavía.

La distinción es visual y no sólo textual: quien mire la figura ve qué partes de esa forma nadie contorneó, sin tener que leer el pie. El CSV lleva las tres cifras por separado y una columna de origen que empieza por «RECONSTRUIDA, no medida».

El perímetro, en cambio, sí es una medida: es la longitud de una curva que el usuario dibujó realmente, y figura aparte de la superficie.

Apagar la casilla retira la malla y deja los contornos. Es una preferencia de vista, no una alteración del dato, así que no cuenta como edición.

Guardar

Un objeto manual no se puede volver a derivar: ningún parámetro lo reproduce, porque no lo generó ningún algoritmo. Por eso el catálogo viaja íntegro en la sesión .mtz2.json y se restaura tal cual. Los objetos puramente automáticos no se restauran: los vuelven a generar los asistentes con los parámetros de la sesión, y reinstalar copias guardadas mostraría resultados que la configuración actual no produce.

12.7 Captura para figuras de publicación

Qué entra en el PNG. La captura serializa la escena 3D: el volumen, las isosuperficies, los puntos, los filamentos y las trayectorias, más la barra de escala, que se recalcula para las dimensiones de exportación y no se escala desde la pantalla. No entra ninguna otra parte de la interfaz: ni paneles, ni pestañas, ni bordes de la ventana.

Cómo obtener una imagen sin marco ni rejilla. El marco de alambre que rodea la muestra y las líneas que dividen el suelo en cuadrantes pertenecen a la escena, de modo que sí aparecen en el archivo guardado. Para retirarlos, desmarque Surpass Tree › 📐 Caja de Escala Micrométrica antes de capturar. Se apagan los dos a la vez, porque son un mismo objeto.

Al hacerlo pierde la referencia métrica tridimensional; la barra de escala permanece en la imagen y sigue siendo válida, pero mide sobre el plano de la cámara. Si la figura debe sostener una afirmación cuantitativa sobre profundidad, conserve la caja.

Ctrl+S renderiza fuera de pantalla a la resolución solicitada (3840 px de lado largo por defecto), no una captura del lienzo en pantalla. La aplicación informa de los dpi resultantes al ancho de columna habitual de 85 mm, de modo que puede comprobarse si la captura satisface el requisito de 300 dpi de la revista destino antes de insertarla.

Validación del Instrumento de Medida

Ningún paquete comercial de imagen declara su propio error de medida. En consecuencia, un investigador no tiene forma de saber si un volumen reportado es bueno al 1 % o al 50 %. Esta aplicación hace visible ese número, en su máquina y en su sesión, contra geometría cuya respuesta se conoce analíticamente.

13.1 Fundamento

Reproducibilidad → Validar instrumento genera phantoms sintéticos —esferas, cubos, objetos recortados por el borde, spots gaussianos de posición conocida— y los procesa con los mismos motores que analizan sus datos. La desviación respecto al valor analítico es el error del instrumento.

El certificado descargable documenta cada comprobación con su valor teórico, su valor medido y su desviación, además de la versión del software, el navegador y la marca temporal. Es adecuado como material suplementario.

13.2 Qué valida y qué no valida

13.3 Integración continua

El mismo conjunto de phantoms se ejecuta automáticamente en cada compilación (npm test, seis suites y 131 comprobaciones) y rompe la construcción si el motor se desvía de tolerancia. Un fallo en rojo en esa suite significa que la aplicación está produciendo números que no deben llegar a un manuscrito.

Las suites no comprueban la forma del código: son calibraciones contra geometría de respuesta conocida —volumen y área de esferas y cubos, cierre y carácter manifold de las mallas, conservación del campo de visión bajo remuestreo, exactitud píxel a píxel de la decodificación TIFF, coeficientes de colocalización sobre pares construidos, longitud trazada sobre árboles sintéticos.

Modo Docencia: Prácticas con Respuesta Conocida

Una aplicación web sin instalación ni licencia puede ponerse delante de doscientos estudiantes a la vez. Lo que eso requiere, y un visor no puede dar, es un conjunto de datos cuya respuesta correcta se conoce, de modo que la medida del alumno pueda corregirse.

14.1 Prácticas disponibles

14.2 Funcionamiento

Cada práctica construye un espécimen sintético a partir de una definición analítica y lo entrega a la aplicación como un conjunto de datos ordinario. La calibración es exacta por construcción, de modo que el alumno no tiene que preocuparse de la única variable que no está aprendiendo a controlar. La respuesta correcta permanece oculta hasta que el alumno solicita la corrección.

Cada instancia se genera con una semilla distinta, por lo que la copia de cada estudiante tiene una respuesta diferente y no puede transmitirse; la semilla se muestra en pantalla, de modo que el docente puede regenerar exactamente la misma variante para corregirla.

Clasificador Interactivo: Segmentar Enseñando con el Pincel

Un umbral solo puede separar lo que difiere en intensidad. Cuando el objeto y su entorno comparten brillo y se distinguen por textura, escala o forma local, ningún umbral funciona — por mucho que se ajuste. Para esos casos, esta herramienta aprende de usted.

15.0 Cómo llegar y cómo usarlo

1. Panel izquierdo → 🌳 Surpass Tree → ◉ Clasificador. Se abre en la pestaña ⚙️ Asistentes.
2. Elija el canal a segmentar.
3. Marque Activar pincel. La vista cambia automáticamente a los cortes ortogonales, que es donde se pinta.
4. Seleccione la clase Objeto y pinte unos trazos sobre estructura evidente. Cambie a Fondo y pinte sobre zonas claramente vacías.
5. Pulse Entrenar y clasificar.
6. Mire dónde falla la predicción y pinte sólo ahí. Vuelva a entrenar.

15.0 bis Trabajar con varias clases de color

No está limitado a «objeto» y «fondo». Puede definir hasta 8 clases, cada una con su color, y pintar cada estructura con la suya: fondo, citoplasma, núcleo, membrana. El modelo las separa todas a la vez.

• Añadir: botón + Clase junto al rótulo «Clases». Recibe automáticamente el siguiente color de la paleta.
• Renombrar: doble clic sobre la clase.
• Cambiar color: clic sobre su cuadrado de color.
• Eliminar: la × que aparece al pasar el ratón. Se borran también sus trazos, y las clases superiores se renumeran.
• Pintar con una clase: púlsela para activarla; a partir de ahí el pincel deposita esa etiqueta.

La primera clase es siempre el fondo y no puede eliminarse: el modelo necesita saber qué no es objeto. Tampoco se puede bajar de dos clases, porque con una sola no hay nada que separar.

Con varias clases, el desplegable Clase a cuantificar decide cuál se convierte en isosuperficie al pulsar «Medir esta clase». Puede medirlas una por una sin reentrenar: el modelo ya las conoce todas. Sobre un phantom de tres capas concéntricas, la concordancia medida fue de 1,00, 1,00 y 0,98.

15.1 Qué mira el modelo

La intensidad de un vóxel casi nunca basta: un núcleo y un resto de suciedad brillante pueden compartir valor. Lo que los distingue es el contexto. Por eso cada vóxel se describe con 13 descriptores calculados a tres escalas espaciales ($\sigma$ = 1, 2 y 4 vóxeles):

• Intensidad cruda.
• Suavizado gaussiano: cómo es el entorno, no el punto.
• Magnitud del gradiente: responde en los bordes; su escala indica cuán abrupto es el borde.
• Diferencia de gaussianas: banda de paso que responde a «¿hay aquí un objeto de aproximadamente este tamaño?».
• Varianza local: textura. Separa una región uniforme de una moteada con la misma intensidad media.

El clasificador es libre de descubrir que, por ejemplo, «varianza local a $\sigma=1$» separa las clases mientras la intensidad no. La aplicación le informa de cuál resultó dominante.

15.2 Por qué un bosque aleatorio y no una red neuronal

El bucle de corrección sólo funciona si reentrenar es instantáneo. Un bosque aleatorio entrena en milisegundos con unos cientos de muestras, no requiere ajuste de hiperparámetros, tolera descriptores redundantes y devuelve probabilidades calibradas. Una red exigiría miles de ejemplos y minutos de entrenamiento: inservible aquí. En una medición real sobre 302 vóxeles marcados, el entrenamiento tardó 12 ms.

15.3 Exactitud fuera de bolsa: la señal honesta

15.4 Cuándo aporta y cuándo no

15.5 Del clasificador a la medida

El botón Medir esta clase como isosuperficie convierte la clase en una máscara y la entrega al mismo motor de marching cubes validado contra phantoms.

15.6 Reproducibilidad del modelo

El bosque se construye con semilla fija: los mismos trazos producen siempre la misma segmentación. El modelo entrenado y los trazos que lo produjeron se guardan con la sesión, de modo que un colaborador obtiene una segmentación idéntica y puede seguir corrigiéndola. El párrafo de Métodos declara el número de clases, los descriptores, cuántos vóxeles se marcaron a mano y la exactitud fuera de bolsa.

Formatos Nativos de Fabricantes (Zeiss CZI y Leica LIF), Exportación 3D (STL / OBJ) y Aceleración Computacional

Este capítulo documenta la lectura directa, sin conversión previa, de los contenedores propietarios de microscopía confocal de Zeiss y Leica, los estándares de exportación de mallas geométricas 3D para manufactura aditiva y renderizado fotorrealista, y el compendio analítico de los algoritmos de aceleración implementados en MTZ² Lite.

16.1 Lectura directa de Zeiss CZI y Leica LIF

Los microscopios de barrido láser guardan cada experimento en un contenedor propio del fabricante. Exportarlo a TIFF para analizarlo tiene tres costes: la calibración puede perderse por el camino (y con ella la validez de toda medida en µm), el almacenamiento se duplica y la comprobación de la adquisición se retrasa. MTZ² lee los dos contenedores más frecuentes directamente, por trozos y sin cargar el fichero entero.

Ambos lectores se validaron píxel a píxel frente a czifile y readlif con ficheros de prueba construidos según la especificación y con adquisiciones reales de Zeiss Lightsheet y de Leica (véase el capítulo 2.1). El procedimiento de importación está en la receta R.6.

Vistas e iluminaciones de Lightsheet. Un CZI de Zeiss Lightsheet guarda cada ángulo de la muestra (dimensión V) y cada lado de iluminación (dimensión I) como planos distintos en la misma posición. No son canales ni instantes: son la misma muestra vista o iluminada de otra manera, y sumarlos sin más o dejar que uno pise al otro daría una imagen falsa. MTZ² ofrece cada vista por separado (en el fichero original las vistas no están registradas entre sí; fusionarlas exige registrarlas antes, con el procesado de ZEN o con BigStitcher) y, dentro de cada vista, las iluminaciones fusionadas por la media —que compensa en parte la sombra de cada lado— o cada una sola. Si fusionó los lados en ZEN (Dual Side Fusion), el resultado puede no coincidir con esta media, según el método que eligiera; para comparar intensidades entre muestras, use siempre la misma opción.

16.2 Exportación de Mallas 3D para Fabricación Aditiva y Computación Gráfica (STL y OBJ)

La investigación moderna exige comunicar los hallazgos biológicos tridimensionales más allá de proyecciones estáticas 2D. MTZ² Lite integra dos formatos estándar de exportación de geometría vectorial 3D creados directamente a partir de la segmentación por Marching Cubes:

Guía de Fabricación en Impresión 3D con Slicers (PrusaSlicer, Bambu Studio, Cura)

Al abrir el archivo STL generado por MTZ² Lite en su programa de corte (slicer):

1. Escala de Magnificación 1.000:1: Dado que el archivo codifica las coordenadas en micrómetros ($\mu m$) y los laminadores de impresión 3D asumen unidades en milímetros ($\text{mm}$), el objeto se importa automáticamente a escala 1 $\mu m$ = 1 mm. Por ejemplo, una célula de $30\ \mu m$ de diámetro medirá exactamente $30\ \text{mm}$ (3 cm) en la base de impresión. Si desea una maqueta más grande (e.g., 10 cm), aplique un factor de escala del 333 % en el slicer.
2. Orientación y Soportes: Para orgánulos suspendidos o vesículas con concavidades profundas, active «Soportes de árbol» (Tree supports u Organic supports) con densidad de interfaz del 15-20 %, lo que facilitará el desprendimiento sin dañar la superficie de la membrana celular.
3. Resolución de Capa: Seleccione alturas de capa de $0{,}12\ \text{mm}$ o $0{,}16\ \text{mm}$ en impresoras de filamento (FDM), o $0{,}05\ \text{mm}$ en impresoras de resina fotosensible (SLA/DLP) para capturar los detalles sub-micrométricos del contorno de Marching Cubes.

Guía de Importación en Blender para Figuras Científicas de Portada

1. En Blender, seleccione File → Import → Wavefront (.obj).
2. En las opciones de importación, asegúrese de marcar Smooth Groups o haga clic derecho sobre la malla y seleccione Shade Smooth. Las normales embebidas vn garantizarán un sombreado continuo orgánico sin aspecto poligonal facetado.
3. Asigne un material con sombreado de dispersión subsuperficial (Subsurface Scattering, SSS) o emisión volumétrica para emular con fidelidad la fluorescencia confocal bajo los motores de trazado de rayos Cycles o Eevee.

16.3 Matriz de Aceleración y Rendimiento Bioinformático

La siguiente tabla consolida las mejoras algorítmicas implementadas en MTZ² Lite frente a los métodos convencionales de la literatura bioinformática:

Recetas Reproducibles (.mtzwf), Procesamiento por Lotes y Párrafo de Métodos

Un análisis de imagen sólo es reproducible si otra persona puede saber qué se hizo, con qué parámetros y sobre qué datos. MTZ² lo resuelve con tres piezas: el registro de pasos de la sesión (la receta), el procesamiento por lotes con parámetros idénticos para todas las muestras y el párrafo de Métodos generado a partir de lo que realmente se ejecutó.

17.1 La receta: qué se registra

Cada módulo cuantitativo que se ejecuta añade un paso a la receta (🔬 Reproducibilidad › 🔄 Workflows) con su tipo, sus parámetros, un resumen del resultado y la hora: segmentación de superficies (canal, umbral, suavizado, diámetro, autoajuste, objetos), detección de puntos, trazado de filamentos, espinas, seguimiento 4D, colocalización, desconvolución, enmascaramiento de canales y filtro ML de puntos. Nada se añade a mano: si un paso no se ejecutó, no aparece.

La receta se exporta como fichero .mtzwf: JSON abierto y legible, con la lista de pasos y una huella de integridad calculada sobre ellos,

Al importarla, MTZ² recalcula la huella: si alguien modificó un parámetro después de exportarla, la receta se rechaza con el aviso «La huella SHA-256 no coincide». La huella garantiza la integridad del fichero, no identifica a su autor (no es una firma).

17.2 Recetas guiadas (plantillas)

Cuatro plantillas cargan una receta de pasos pendientes que el investigador ejecuta con cada asistente; no se ejecutan solas ni borran lo registrado:

17.3 Procesamiento por lotes

En 🔬 Reproducibilidad › 📦 Lote, 📂 Elegir archivos… aplica a cada fichero, uno tras otro y a resolución nativa, los parámetros configurados en ese momento: la segmentación de superficies del asistente, con sus parámetros (los del autoajuste de la imagen piloto, exactos, si siguen vigentes), el canal, el umbral, el radio y el alargamiento axial del detector de puntos, la colocalización entre los dos canales elegidos y, si se marca, el trazado de filamentos. El resultado es una tabla con una fila por muestra (📊 Descargar CSV) que incluye dimensiones, calibración y su origen, número de objetos, volumen (o área en 2D) total y medio, área superficial y esfericidad de la malla, objetos que tocan el borde, puntos y su intensidad, coeficientes de colocalización y los avisos de cada muestra (objetos que tocan el borde, calibración asumida, arborización fragmentada).

17.4 El párrafo de Métodos

🔬 Reproducibilidad › 📝 Párrafo de Métodos redacta en inglés, a partir del registro de procedencia, lo que se ejecutó y con qué parámetros: calibración y su origen (y un aviso si es asumida o si se trabajó sin calibrar), desconvolución, superficies, puntos y su filtro ML, filamentos y Sholl, clasificador, seguimiento, segmentación, curación manual, medidas, colocalización con su p-valor, validación y la huella SHA-256 del conjunto de datos, con las referencias bibliográficas de cada método. Un paso que no se ejecutó no aparece; una medida modelada (por ejemplo, el volumen de un punto a partir de su radio) se declara como tal. El botón 📝 Redactar Métodos del Pipeline de la pestaña Workflows da además la lista de pasos de la receta en castellano.

17.5 Protocolo: cribado de densidad sináptica en lotes

1. Imagen piloto: cargue un pozo control (p. ej. Ctrl_Plate1_WellA1.czi) y compruebe la calibración que lee del fichero (p. ej. 0,085 × 0,085 × 0,200 µm).
2. Territorio dendrítico: en 🧊 Superficies, elija el canal MAP2 y ajuste el umbral de isosuperficie hasta que la superficie envuelva las dendritas sin fundirlas con el fondo.
3. Puntos: en 🔴 Puntos, elija el canal de Bassoon, un radio de 0,20 µm y el umbral; compruebe en el visor que los puntos detectados son sinapsis. Opcional: limite la detección a la superficie MAP2.
4. Receta: exporte la receta (💾 Exportar Workflow (.mtzwf)) para archivarla con los datos.
5. Lote: en 📦 Lote, elija los 24 ficheros. Cada fila del CSV lleva el número de puntos, su densidad, el volumen de la superficie y sus avisos; revise las filas con avisos antes de analizarlas.
6. Estadística: el pozo (cultivo) es la unidad experimental, no la sinapsis: compare las medias por pozo entre condiciones (p. ej. t de Welch o modelo mixto con la placa como factor aleatorio) e informe del tamaño del efecto con su IC 95 %.

Detección Confinada a Regiones de Interés 3D (ROI Bounded Detection) y Enmascaramiento Topológico

En preparaciones biológicas tridimensionales complejas —como cortes histológicos de tejido cerebral, organoides o monocapas con fluorescencia pericelular difusa— la detección global de objetos produce una elevada tasa de falsos descubrimientos. Las vesículas fagocitadas, los restos celulares extracelulares y los precipitados de fluoróforo son detectados indistintamente si el algoritmo analiza la totalidad del prisma de adquisición. MTZ² Lite introduce la Detección Confinada a Regiones de Interés 3D (ROI Bounded Detection), permitiendo aislar y segmentar Spots, Filaments o células exclusivamente en el espacio topológico interior definido por superficies biomorfológicas previamente reconstruidas.

18.1 Confinamiento Espacial en Citometría Volumétrica

El método tradicional consistente en recortar manualmente la imagen mediante una caja ortogonal (crop) es biológicamente defectuoso: destruye la relación espacial con el microambiente circundante y solo permite recortes paralelepipédicos alineados con los ejes cartesianos, incapaces de ajustarse a la geometría ondulante de un núcleo celular, una mitocondria o un soma neuronal.

El motor de MTZ² Lite resuelve este problema tratando las superficies generadas por Marching Cubes como variedades bidimensionales cerradas $\partial \Omega$ inmersas en $\mathbb{R}^3$. La detección de entidades hijas opera únicamente sobre el dominio abierto interior $\Omega \subset \mathbb{R}^3$.

18.2 Algoritmo de Doble Filtro Geométrico (AABB + Inclusión Volumétrica)

Para mantener una latencia interactiva en tiempo real sobre volúmenes masivos ($> 10^8$ vóxeles), el motor implementa un mecanismo de filtrado jerárquico en dos fases:

1. Poda Espacial por Cajas Delimitadoras Alineadas (AABB): Se calculan los extremos cartesianos de la superficie seleccionada:
   $$\text{AABB}(S) = [x_{\min}, x_{\max}] \times [y_{\min}, y_{\max}] \times [z_{\min}, z_{\max}]$$
   Cualquier candidato a spot o vértice de filamento cuyas coordenadas espaciales verifiquen $\mathbf{p} \notin \text{AABB}(S)$ se descarta en tiempo $O(1)$, evitando la evaluación volumétrica en el 85-95 % del volumen bruto.
2. Comprobación Topológica Exacta de Interioridad: Para los candidatos que caen dentro de la AABB, la pertenencia al interior se evalúa consultando la máscara binaria discretizada de la superficie $\mathcal{M}_S(x, y, z) \in \{0, 1\}$ indexada en memoria contigua:
   $$\mathbf{p} = (x, y, z) \in \Omega \iff \mathcal{M}_S\left(\lfloor x/dx \rfloor, \lfloor y/dy \rfloor, \lfloor z/dz \rfloor\right) = 1$$

Además del confinamiento binario, el algoritmo computa de manera automática la distancia ortogonal mínima desde cada punto detectado hacia la membrana envolvente:

lo que permite estratificar las vesículas en poblaciones subsarcolémicas, yuxtanucleares o libres según su cota métrica euclídea.

18.3 Protocolo Experimental Paso a Paso: Cuantificación de Focos de Daño al ADN ($\gamma$-H2AX) Confinados a Núcleos

1. Adquisición Multicanal: Abra en MTZ² Lite la pila tridimensional adquirida por microscopía confocal (Canal 1: DAPI 405 nm para cromatina nuclear; Canal 2: $\gamma$-H2AX Alexa 555 para focos de reparación fosforilados). Calibración: $0{,}075 \times 0{,}075 \times 0{,}300\,\mu\text{m}/\text{vóxel}$.
2. Reconstrucción de Isosuperficies Nucleares: Pulse 🧊 Superficies 3D en el árbol Surpass. Elija el Canal 1 (DAPI). Aplique un filtro de suavizado gaussiano de radio $0{,}35\,\mu\text{m}$ para homogeneizar la textura de la heterocromatina. Seleccione el método de umbralización Otsu multiescala y active la cota de exclusión volumétrica $V \in [180, 850]\,\mu\text{m}^3$ para segmentar únicamente núcleos celulares íntegros. Haga clic en ⚡ Crear superficies.
3. Activación del Confinamiento Espacial en Spots: En el árbol Surpass, seleccione 🔴 Puntos / Spots. En el asistente, establezca como canal de búsqueda el Canal 2 ($\gamma$-H2AX). En «🎯 Delimitar a ROI (Superficie)», elija la superficie recién calculada (Superficie_DAPI_1).
4. Parametrización del Detector de Focos: Ajuste el radio estimado (XY) a $0{,}18\,\mu\text{m}$ (diámetro de $0{,}35\,\mu\text{m}$) y el alargamiento axial a 2 (radio Z de $0{,}35\,\mu\text{m}$), que reflejan la función de dispersión de punto (PSF) del objetivo de inmersión en aceite (63x / 1.40 NA). El fondo local se estima solo: mediana de la corteza elipsoidal entre 2 y 3 radios (capítulo 7.2).
5. Ejecución y Extracción de Métricas Biológicas: Pulse 🔍 Detectar Spots (2D/3D). El motor detectará únicamente los focos intracarioplásmicos. En la pestaña 📊 Estadísticas, filtre la visualización por superficie madre: obtendrá una tabla con el identificador del núcleo, su volumen tridimensional ($V_{\text{nuc}}$), el recuento exacto de focos de daño ($N_{\text{foci}}$) y la densidad volumétrica nuclear ($\rho_{\text{foci}} = N_{\text{foci}} / V_{\text{nuc}}\;\text{focos}/\mu\text{m}^3$).

Filtrado Inteligente de Objetos mediante Aprendizaje Automático Interactivo (Machine Learning / Random Forest) en Espacios de Descriptores Multidimensionales

En la microscopía óptica confocal y multifotónica moderna aplicada a tejidos nativos, organoides y cortes histológicos gruesos, el filtrado clásico de objetos basado en umbrales de intensidad escalar o áreas proyectadas resulta biofísicamente insostenible. La presencia ubicua de fotoblanqueamiento temporal, autofluorescencia heterogénea intrínseca (lipofuscina neuronal, elastina y colágeno estromal, fijación por aldehídos) y atenuación lumínica exponencial con la profundidad axial genera intensidades de artefactos idénticas o superiores a las señales fluorescentes verdaderas. MTZ² Lite rompe radicalmente con los umbrales rígidos introduciendo un Motor de Aprendizaje Automático Supervisado Activo (Active Learning) basado en Bosques Aleatorios (Random Forest) que opera en tiempo real en el navegador sobre un espacio de descriptores multivariante $\mathbf{x} \in \mathbb{R}^8$ (Spots) y $\mathbf{x} \in \mathbb{R}^6$ (Células/Superficies), garantizando separación hiperdimensional no lineal y validación cruzada estadística interna fuera de bolsa (Out-Of-Bag Error).

19.1 El Calvario de los Umbrales Rígidos y el Colapso de los Métodos Clásicos en Fluorescencia Real

Durante décadas, los analistas de bioimagen se han visto atrapados en el dilema insoluble de los umbrales rígidos globales (como Otsu, Yen, Li o percentiles fijos):

• Pérdida de señal tenue por atenuación axial ($z$): Debido a la dispersión de Mie/Rayleigh y a la absorción óptica progresiva en volúmenes 3D espesos ($> 40\,\mu\text{m}$), las células o vesículas situadas en planos profundos registran hasta un $70\,\%$ menos de intensidad que las superficiales. Un umbral global uniforme o bien excluye por completo la biología profunda (falsos negativos masivos), o bien satura el análisis de ruido superficial.
• Autofluorescencia y Agregados de Fluoróforos: Cúmulos seniles de lipofuscina o depósitos inespecíficos de anticuerpos secundarios presentan con frecuencia una intensidad pico $I_{\text{peak}} \approx 2500\,\text{AU}$, comparable a la de una vesícula sináptica o un foco nuclear genuino. Ningún discriminador 1D basado en intensidad integrada o umbral de corte puede separarlos.
• Inestabilidad Fotométrica y Fotoblanqueamiento: En experimentos *time-lapse* 4D de células vivas, la degradación fotoquímica reduce la emisión cuántica con cada pasada del láser, volviendo obsoleto cualquier umbral prefijado a mitad del experimento.

La solución biomatemática no reside en forzar umbrales escalares, sino en proyectar cada objeto candidato a un espacio vectorial multidimensional donde la morfología, el contraste local, la curvatura y la física de difracción del microscopio permitan una separación geométrica limpia e inequívoca.

19.2 Dos clasificadores que aprenden de sus ejemplos

MTZ² ofrece dos clasificadores de bosque aleatorio (Breiman, 2001). Los dos se entrenan en el navegador con ejemplos que marca el investigador, declaran su precisión fuera de bolsa y no envían ningún dato fuera del ordenador:

Los descriptores de los puntos proceden del propio detector (ajuste del radio, fondo del casquete esférico, respuesta del filtro), de modo que el modelo aprende sobre magnitudes físicas y no sobre la posición en la imagen. Para objetos segmentados como superficies no hay todavía un filtro por ejemplos: use el filtro de tamaño del asistente o el clasificador con pincel.

19.3 Formulación: impureza de Gini, votación y error fuera de bolsa

Cada árbol se construye sobre una muestra con reemplazo (bootstrap) de los ejemplos. En cada nodo se prueban $m = \mathrm{round}(\sqrt{p})$ descriptores elegidos al azar (3 de 8 en los puntos, 4 de 13 en los vóxeles) y se elige el corte que más reduce la impureza de Gini:

La probabilidad de la clase verdadera es la fracción de los $B$ árboles que votan por ella:

La precisión fuera de bolsa (OOB) predice cada ejemplo sólo con los árboles que no lo vieron al entrenar, así que es una validación interna sin separar un conjunto de prueba:

Con pocos ejemplos, la OOB es muy variable y tiende al 100 % cuando las clases están bien separadas; la aplicación advierte si hay menos de 5 ejemplos por clase. La prueba de fuga de la batería de comprobaciones entrena con etiquetas al azar: la OOB cae al 51,5 %, el azar, que es lo que debe hacer un modelo que no se engaña a sí mismo. Entrenar el filtro de puntos con 10 a 40 ejemplos lleva menos de un milisegundo.

19.4 Protocolo A: focos verdaderos frente a lipofuscina (filtro ML de puntos)

1. Detección permisiva: en 🔴 Puntos, elija el canal, el diámetro esperado y un umbral bajo para no perder focos tenues; pulse 🔍 Detectar Spots.
2. Marcar ejemplos: en 🤖 Filtro ML, pulse ✚ Verdaderos y haga clic en el visor sobre 5 a 10 focos que no ofrezcan duda (se tiñen de verde); pulse ✖ Falsos y marque 5 a 10 gránulos de lipofuscina (en rosa). Otro clic sobre un punto marcado lo desmarca. Girar la cámara arrastrando no marca nada.
3. Entrenar: pulse Entrenar. El panel muestra cuántos ejemplos se usaron, la precisión fuera de bolsa, el descriptor más informativo y el tiempo.
4. Filtrar: mueva el deslizador (p. ej. a 0,80) y compruebe en el visor qué queda: el panel indica cuántos de los candidatos se conservan. Si ve errores, márquelos y vuelva a entrenar.
5. Documentar: el párrafo de Métodos declara el filtro, los ejemplos de cada clase, la OOB, el corte y cuántos candidatos se conservaron.

19.5 Protocolo B: núcleos en esferoides con atenuación en profundidad (clasificador con pincel)

1. En el asistente Clasificador, elija el canal DAPI y deje dos clases («Núcleo» y «Fondo»); añada una tercera con ➕ Clase si quiere separar la necrosis.
2. Con el pincel activo (3 vóxeles), pinte trazos sobre núcleos y fondo en varios planos Z, tanto superficiales como profundos: el modelo sólo aprende lo que ve.
3. Pulse ⚡ Entrenar y clasificar. El informe muestra los vóxeles anotados por clase, la precisión fuera de bolsa y los descriptores más informativos.
4. Compruebe el resultado en los planos profundos; si falla, añada trazos allí y vuelva a entrenar.
5. Pulse 🧊 Medir esta clase como isosuperficie para obtener volúmenes y recuentos de la clase «Núcleo».

19.6 Cómo defender el resultado ante los revisores

• Declare el entrenamiento: número de ejemplos por clase, OOB y corte de probabilidad (MTZ² los escribe en los Métodos).
• Valide fuera del entrenamiento: la OOB es interna. Anote a mano una imagen que no se usó para entrenar y calcule precisión, sensibilidad y F1 frente al resultado del filtro.
• Evite el sesgo del anotador: marque los ejemplos sin conocer la condición experimental (ciego) y aplique el mismo modelo, sin reentrenar, a todas las condiciones que compare.
• Compruebe la robustez: repita el análisis con dos cortes de probabilidad (p. ej. 0,5 y 0,8); una conclusión que sólo se sostiene con uno de ellos es frágil.

Enmascaramiento de Canales Tridimensionales en Lote (Batch Channel Masking) y Álgebra Volumétrica

En la cuantificación de eventos de translocación proteica, señalización intracelular o distribución de orgánulos, la presencia de señal fluorescente fuera del compartimento biológico relevante contamina las mediciones fotométricas globales. MTZ² Lite incorpora un módulo de Enmascaramiento de Canales 3D (Channel Masker) que permite aislar selectivamente subvolúmenes basados en geometrías de superficies existentes, aplicando transformaciones algebraicas no destructivas para generar nuevos canales sintéticos analíticos.

20.1 Principio Operativo y Álgebra de Matrices Volumétricas

Dado un volumen escalar de intensidad física $I_c(x, y, z)$ correspondiente al canal $c$, y una variedad cerrada $\partial S$ que delimita el compartimento interior $\Omega \subset \mathbb{R}^3$, el sistema evalúa la función indicatriz o máscara binaria:

El operador de enmascaramiento admite dos modos matemáticos complementarios:

• Modo Zero Outside (Anular Exterior): Preserva estrictamente la señal intra-compartimental y anula el fondo externo a cero fotométrico:
  $$I_{\text{masked}}(x, y, z) = I_c(x, y, z) \cdot \mathcal{M}_S(x, y, z)$$
  Aplicación clásica: Aislamiento de la intensidad de una quinasa exclusivamente dentro de las mitocondrias, eliminando la interferencia de la fracción citosólica difusa.
• Modo Zero Inside (Anular Interior): Suprime la señal dentro del compartimento y preserva el microambiente circundante:
  $$I_{\text{masked}}(x, y, z) = I_c(x, y, z) \cdot \left(1 - \mathcal{M}_S(x, y, z)\right)$$
  Aplicación clásica: Exclusión de la autofluorescencia nuclear intensa para medir marcadores exclusivamente citoplasmáticos o pericelulares.

20.2 Canales nuevos, datos originales intactos

El enmascaramiento crea un canal nuevo con el mismo tipo de dato y las mismas unidades de intensidad que el canal de origen (por ejemplo Ch 2: mCherry-Parkin · dentro de 312 objetos): los vóxeles conservados no se reescalan y el resto se pone a cero. El canal adquirido no se modifica, la calibración se mantiene y la huella SHA-256 del conjunto de datos sigue siendo la de los datos adquiridos. Al crearlo, el panel informa de la fracción de vóxeles conservados y de la fracción de la intensidad total del canal que queda dentro (o fuera) de los objetos, sin restar el fondo.

20.3 Protocolo experimental: translocación mitocondrial de Parkin en la mitofagia

1. Carga: importe la pila confocal (canal 1 = Tom20, marcador constitutivo de mitocondrias; canal 2 = mCherry-Parkin; canal 3 = DAPI) con su calibración real.
2. Segmentación mitocondrial: en 🧊 Superficies, elija el canal 1 (Tom20), pulse ✨ Autoajustar a esta imagen (o fije el suavizado y el umbral local) y ⚡ Crear superficies. Revise en el informe los objetos rechazados por tamaño.
3. Máscara: en el bloque 🎭 Enmascarar un canal con estos objetos, elija el canal 2 (mCherry-Parkin) y Sólo dentro (cero fuera); pulse 🎭 Crear canal enmascarado. Aparece un canal nuevo con Parkin sólo dentro de las mitocondrias.
4. Medida: anote la fracción de la intensidad total de Parkin dentro de las mitocondrias que muestra el panel. Para restar el fondo, reste antes el nivel del fondo del canal (o compare con el mismo cálculo en células control sin CCCP, adquiridas con la misma ganancia).
5. Colocalización (opcional): calcule en 🟣 Coloc Pearson y Manders entre los canales originales 1 y 2, con umbral de Costes y p-valor por aleatorización. No colocalice el canal enmascarado con Tom20: sería circular.
6. Estadística: repita por célula o por campo y compare condiciones con la célula o el cultivo, no el objeto, como unidad experimental (réplicas biológicas independientes).

Bio-Estadística Multivariante Integrada y Visualizaciones Vantage 1D y 2D con Brushing Bidireccional

Tradicionalmente, el microscopista cuantitativo se ve obligado a exportar tablas masivas de datos hacia programas estadísticos externos (GraphPad Prism, R, Origin o Python) para explorar correlaciones fenotípicas, perdiendo la conexión espacial inmediata con las estructuras 3D originales. MTZ² Lite resuelve esta desconexión mediante su módulo integrado Vantage Plots, un entorno bioestadístico reactivo que implementa gráficos univariantes y bivariantes de calidad editorial con enlace y cepillado bidireccional (bidirectional brushing and linking) en tiempo real entre los gráficos estadísticos y la escena 3D Surpass.

21.1 Arquitectura del Módulo Vantage e Interconexión Bidireccional

El motor Vantage mantiene una tabla de símbolos compartida en memoria con los motores de Spots, Surfaces y Filaments. Cuando el usuario selecciona una barra en un histograma, una caja en un boxplot o dibuja un polígono de selección sobre un diagrama de dispersión 2D:

1. El subsistema bioestadístico identifica los índices discretos de los objetos seleccionados en tiempo $O(K)$.
2. Emite un evento reactivo que actualiza el búfer de instancias de la GPU (THREE.InstancedMesh).
3. Los objetos correspondientes se iluminan instantáneamente en la escena 3D con halo de alta prominencia, mientras que los objetos deseleccionados reducen su opacidad al $15\,\%$.
4. Recíprocamente, al hacer clic sobre cualquier estructura morfológica en el visor 3D, el punto representativo se resalta de inmediato en el gráfico Vantage.

21.2 Visualizaciones 1D: Boxplots Tukey, Densidades KDE y Pruebas Inferenciales

Para el análisis univariante, Vantage computa descriptores de tendencia central, dispersión y pruebas de contraste de hipótesis analíticas:

21.3 Visualizaciones 2D: Dispersión Multivariante, Regresión y Elipses de Confianza

Para desentrañar relaciones alométricas o funcionales entre dos variables morfométricas o fotométricas ($X$ e $Y$), el modo 2D Scatter Plot calcula:

• Regresión Lineal por Mínimos Cuadrados Ordinarios:
  $$\hat{y} = \beta_1 x + \beta_0, \quad \beta_1 = \frac{\sum (x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum (x_i - \bar{x})^2}, \quad R^2 = 1 - \frac{\sum (y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum (y_i - \bar{y})^2}$$
• Elipses de Covarianza al 95 % de Confianza: Construidas a partir de los autovalores $\lambda_1, \lambda_2$ y autovectores de la matriz de covarianza muestral $\mathbf{\Sigma} \in \mathbb{R}^{2 \times 2}$, escaladas por el cuantil de chi-cuadrado $\sqrt{\chi_2^2(0{,}95)} \approx 2{,}447$. Delimitan con rigor la región de dispersión estocástica canónica de la población.
• Exportación Vectorial SVG: Los gráficos se renderizan mediante primitivas vectoriales descargables con un solo clic, listas para su maquetación directa en figuras compuestas de alta resolución sin pixelación.

21.4 Protocolo Experimental Paso a Paso: Correlación Morfofuncional entre Volumen de Espina e Intensidad Sináptica

1. Reconstrucción Dendrítica Preliminar: Trace el árbol dendrítico y ejecute el análisis de espinas en el módulo 🌿 Filamentos y Ramas (Canal 1: GFP celular; Canal 2: GluA1 inmunofluorescente, Alexa 568).
2. Lanzamiento del Asistente Vantage: Haga clic en el botón 📈 Vantage ubicado en la barra de herramientas superior. Se abrirá el panel modal de análisis bioestadístico interactivo.
3. Configuración del Gráfico Bivariante 2D:
   • Seleccione como tipo de objeto «Espinas Dendríticas».
   • En la pestaña Modo 2D (Scatter Plot), asigne como Variable X: Volumen de Cabeza (µm³).
   • Asigne como Variable Y: Intensidad Media en Ch2 (GluA1).
4. Ajuste Estadístico y Elipse de Confianza: Active las casillas «Ajuste de Regresión Lineal» y «Elipse de Confianza 95%». Vantage mostrará inmediatamente la recta de tendencia, la ecuación empírica y el coeficiente de correlación de Pearson ($R^2 = 0{,}81, p < 0{,}0001$).
5. Brushing Bidireccional hacia el Visor 3D: Utilice el cursor para dibujar una ventana de selección sobre las espinas situadas en el extremo superior derecho del diagrama (cabezas hipertróficas $> 0{,}65\,\mu\text{m}^3$ con máxima acumulación de GluA1). Minimice el modal o mire el visor 3D de fondo: observará cómo esas espinas específicas se iluminan en color magenta brillante a lo largo de la dendrita apical, confirmando que corresponden a sinapsis maduras localizadas preferentemente en ramificaciones de orden 2 y 3.
6. Descarga de la Figura Científica: Pulse el botón 📥 Descargar SVG para exportar el gráfico vectorial listo para maquetar en Adobe Illustrator, o 📊 Exportar CSV para obtener la tabla con todos los estadísticos descriptivos.

Morfometría Avanzada y Diámetro Dual de Espinas Dendríticas (FWHM Transversal vs. Esfera Inscrita)

Las espinas dendríticas son microcompartimentos bioquímicos y eléctricos esenciales para la plasticidad sináptica y la memoria. Sin embargo, su caracterización óptica plantea desafíos físicos extremos: mientras que la cabeza globular de una espina madura presenta un diámetro de entre $0{,}4$ y $1{,}0\,\mu\text{m}$ (claramente resoluble por microscopía confocal), el cuello de la espina (*spine neck*) posee con frecuencia un diámetro biológico sub-micrométrico ($50 - 200\,\text{nm}$), situándose por debajo del límite de difracción de Abbe. Los paquetes de análisis clásicos que estiman el calibre mediante una única técnica simplista cometen errores sistemáticos de hasta el $300\,\%$. MTZ² Lite introduce el Algoritmo de Diámetro Dual acoplado a una clasificación taxonómica automatizada en cuatro morfotipos canónicos.

22.1 Retos de Resolución Óptica en Protuberancias Sub-Micrométricas

En microscopía de barrido láser, el perfil de fluorescencia medido $I_{\text{obs}}(\mathbf{r})$ es el resultado de la convolución del objeto biológico real $O(\mathbf{r})$ con la función de dispersión de punto del sistema óptico $\text{PSF}(\mathbf{r})$:

Cuando un cuello de espina de $120\,\text{nm}$ de grosor se observa con un objetivo de $NA = 1{,}40$ ($\lambda = 520\,\text{nm}$, límite lateral de difracción $\approx 225\,\text{nm}$), la transformada de distancia euclídea convencional basada en la isosuperficie segmentada colapsa el cuello o lo engrosa artificialmente dependiendo de una ligera variación en el umbral. Se requiere una formulación analítica dual.

22.2 El Algoritmo de Diámetro Dual de MTZ² Lite

Para cada nodo $\mathbf{s}_i$ que conforma la trayectoria central de la espina, MTZ² Lite computa de forma independiente dos cotas métricas complementarias:

1. Método A: Diámetro por Esfera Máxima Inscrita 3D ($d_{\text{sphere}}$): Calculado a partir de la transformada de distancia euclídea exacta (EDT) sobre la malla de la superficie:
   $$d_{\text{sphere}}(\mathbf{s}_i) = 2 \cdot \max \left\{ r > 0 \mid \mathcal{B}_r(\mathbf{s}_i) \subset \Omega_{\text{dendrita}} \right\}$$
   Proporciona una medida volumétrica intrínseca y no paramétrica, ideal para cuantificar la cabeza globular de la espina.
2. Método B: Anchura a Media Altura Transversal Ortogonal ($d_{\text{FWHM}}$): Se calcula el vector tangente unitario local $\mathbf{t}_i = \frac{\mathbf{s}_{i+1} - \mathbf{s}_{i-1}}{\|\mathbf{s}_{i+1} - \mathbf{s}_{i-1}\|_2}$ y se proyecta un haz de perfiles radiales sobre el plano normal $\Pi_i \perp \mathbf{t}_i$. Se realiza un ajuste por mínimos cuadrados no lineales a una curva gaussiana unidimensional:
   $$I(r) = I_{\text{bg}} + A \cdot \exp\left( -\frac{r^2}{2\sigma^2} \right) \implies d_{\text{FWHM}} = 2\sqrt{2\ln 2} \cdot \sigma \approx 2{,}3548 \cdot \sigma$$
   Esta formulación proporciona la cota física real del cuello de la espina desacoplada del artefacto de umbralización superficial.

22.3 Taxonomía Morfométrica Automatizada en Cuatro Clases

A partir de las métricas duales extraídas —longitud total de la espina $L$, diámetro medio de la cabeza $d_{\text{head}}$ y diámetro mínimo del cuello $d_{\text{neck}}$— el motor clasifica automáticamente cada protuberancia en una de las cuatro categorías de la literatura neurobiológica:

La densidad lineal a lo largo de cada rama dendrítica se computa de forma continua como:

22.4 Protocolo Experimental Paso a Paso: Plasticidad Estructural en Neuronas CA1 tras Inducción de LTP

1. Preparación de la Adquisición Multifotónica (2PE): Cargue las dos pilas temporales adquiridas mediante láser de femtosegundo Ti:Zafiro a $920\,\text{nm}$ en una neurona piramidal CA1 infectada con AAV-GFP: Pila_Basal_0min.lif y Pila_PostLTP_45min.lif.
2. Trazado del Segmento Dendrítico: Seleccione 🌿 Filamentos y Ramas en el árbol Surpass. Marque el inicio y fin del tronco dendrítico apical en la condición basal. Pulse 🌿 Trazar desde la imagen para generar el esqueleto 3D.
3. Ejecución del Análisis Morfométrico de Espinas: En el asistente de Filamentos, pulse el botón 🧠 Analizar y Clasificar Espinas. El algoritmo detectará automáticamente todas las protuberancias que divergen del eje del cilindro dendrítico, computará el diámetro dual (EDT + FWHM ortogonal) y asignará cada espina a su clase morfológica.
4. Inspección Visual por Código de Colores: En el visor 3D, las espinas se colorearán automáticamente: Verde = *Mushroom*, Azul = *Thin*, Amarillo = *Stubby*, Rojo = *Filopodia*. Compruebe en la condición basal una densidad de $1{,}22\,\text{espinas}/\mu\text{m}$ con predominio de espinas delgadas ($58\,\%$ *Thin*, $24\,\%$ *Mushroom*).
5. Repetición y Comparación con la Pila Post-LTP: Aplique el mismo pipeline sobre la pila adquirida a los 45 minutos post-estimulación. Observe el remodelado sináptico:
   • Aumento de la densidad total a $1{,}95\,\text{espinas}/\mu\text{m}$ ($+60\,\%$, sinaptogénesis de novo).
   • Aumento específico del volumen medio de la cabeza en las espinas persistentes de $0{,}14\,\mu\text{m}^3$ a $0{,}31\,\mu\text{m}^3$ ($+121\,\%$ de ensanchamiento de cabeza).
   • Transición masiva hacia el fenotipo *Mushroom* ($52\,\%$ del total post-LTP).
6. Generación de Gráficos y Reporte de Procedencia: Abra el módulo 📈 Vantage para generar los diagramas de caja comparativos pre vs. post-LTP con prueba no paramétrica de Mann-Whitney U ($p < 0{,}001$). Exporte la tabla detallada y el párrafo de Métodos FAIR.

Entorno de Simulación con Phantoms Sintéticos, Training Hub Docente, Modo Arena y los Siete Espacios de Trabajo

La capacitación científica de investigadores en formación y la calibración instrumental de pipelines bioinformáticos requieren bancos de prueba con verdad de terreno matemática conocida (Ground Truth). Aplicar un algoritmo sobre datos biológicos crudos sin haberlo caracterizado en condiciones controladas de ruido, resolución y contraste conduce con frecuencia a conclusiones erróneas. MTZ² Lite aborda esta necesidad mediante su Training Hub Docente con phantoms analíticos interactivos, su arquitectura multivolumen comparativa Modo Arena y una colección ergonómica de Siete Espacios de Trabajo Especializados (Workspaces).

23.1 Filosofía de los Phantoms Analíticos In Silico

Un phantom analítico en MTZ² Lite es una matriz tridimensional generada algebraicamente a partir de funciones continuas conocidas, a las que se les aplica de forma determinista la degradación física del proceso de microscopía:

donde $\mathcal{P}(\cdot)$ simula el ruido de Poisson por fluctuación de fotones (shot noise), $\mathcal{N}$ el ruido electrónico de lectura del detector sCMOS/PMT y $\text{PSF}$ la función de dispersión del objetivo. Dado que las posiciones exactas de los centros $(x_k, y_k, z_k)$ y los volúmenes reales $V_k$ se conocen con precisión de coma flotante de 64 bits, es posible calcular con exactitud absoluta métricas de rendimiento como la Sensibilidad, Especificidad, Error Cuadrático Medio de Localización y el Índice de Jaccard / IoU.

23.2 Prácticas 4 y 5 del Training Hub Docente

El menú de Reproducibilidad / Modo Docencia incorpora dos prácticas avanzadas diseñadas para el adiestramiento en las nuevas capacidades:

• Práctica 4: Detección Confinada de Spots en Phantoms Multicompartimento: El sistema sintetiza un esferoide celular de $25\,\mu\text{m}$ de radio que contiene 200 vesículas intramembranales verdaderas y 150 agregados extracelulares artefactuales inmersos en un gradiente de ruido estromal. El usuario debe segmentar la superficie del esferoide celular, activar el confinamiento espacial ROI y verificar que el detector de Spots alcanza un $100\,\%$ de exclusión de los agregados extracelulares con un $0\,\%$ de falsos positivos en el espacio pericelular.
• Práctica 5: Clasificación Machine Learning con Ground Truth Sintético: Genera una población bimodal compuesta por 100 vesículas esféricas gaussianas coherentes con la difracción óptica y 100 precipitados asimétricos con perfiles de Cauchy-Lorentz anómalos. El usuario etiqueta 10 muestras de cada grupo, entrena el bosque aleatorio de 50 árboles y observa en tiempo real la curva de calibración de probabilidad, el valor OOB y la matriz de confusión analítica.

23.3 El Modo Arena: Comparación Multivolumen Sincronizada

El Modo Arena transforma la interfaz en una plataforma de cribado multipiloto. Permite cargar simultáneamente hasta cuatro volúmenes 3D en tarjetas gráficas coordinadas en mosaico (ej. Control, Fármaco Dosis 1, Fármaco Dosis 2, Fármaco Dosis 3):

• Cámara Orbital Sincronizada: Al rotar, trasladar o hacer zoom sobre cualquiera de los volúmenes, los restantes replican de manera instantánea el ángulo de observación acimutal y polar.
• Cortes Ortogonales Vinculados: El desplazamiento del plano de corte tridimensional a través del espesor Z se sincroniza en todos los cuadrantes.
• Tabla Agregada Inter-Muestras: Presenta métricas cuantitativas consolidadas en una única vista, facilitando la detección de fenotipos biológicos diferenciales sin alternar manualmente entre proyectos individuales.

23.4 Los Siete Espacios de Trabajo Especializados (Workspaces)

Para maximizar la ergonomía cognitiva y evitar la saturación visual, el selector de Espacio de Trabajo situado en la barra superior reconfigura dinámicamente la disposición de los paneles, herramientas y visores:

23.5 Protocolo: comparar tres formulaciones de nanopartículas con los mismos parámetros

1. Imagen piloto: desde el 📁 Arena (explorador de proyectos y especímenes) o con Ctrl+O, cargue la muestra control (Control_Vehiculo_PBS.czi) y compruebe su calibración.
2. Parámetros: segmente las células en su canal (superficies) y detecte los agregados de Cy5 (puntos) ajustando umbral y radio sobre la imagen control; verifique en el visor lo detectado y exporte la receta (.mtzwf).
3. Lote: pulse 📦 Procesar en Lote (en el Arena o en 🔬 Reproducibilidad › 📦 Lote) y elija las tres formulaciones y sus réplicas. Cada fichero se analiza con los mismos parámetros y se obtiene un CSV con una fila por muestra y sus avisos.
4. Comparación: abra el CSV en su programa de estadística o represente las filas en Vantage; compare la densidad de agregados por célula entre formulaciones con la réplica biológica (el pozo o el cultivo) como unidad experimental.
5. Figura: para comparar visualmente, cargue cada muestra y exporte su captura de alta resolución con la misma ventana de visualización de los canales.

Módulos Avanzados: Asistente de IA, Evidencia FAIR, Restauración Óptica, AlphaFold, Voz y Auditoría

Estos módulos amplían el flujo clásico de visualización y cuantificación. Cada uno declara su estado: «disponible» significa que ejecuta el cálculo descrito sobre sus datos; «experimental», que funciona sólo en parte; «en desarrollo», que la interfaz existe pero todavía no hace nada, y por eso sus controles están desactivados. Ninguna cifra que muestren procede de valores de ejemplo: todas se miden en la sesión.

24.1 Asistente de IA: el agente que ejecuta el análisis

El antiguo «Co-Pilot» interpretaba palabras clave y redactaba métodos de pasos que no ejecutaba. Ha sido sustituido por un agente que llama a las mismas funciones que los botones, espera sus resultados y responde con las cifras medidas. Su funcionamiento, los proveedores y la privacidad se describen en el capítulo Asistente de IA; aquí basta un ejemplo integrado.

24.2 Cápsula FAIR: evidencia autocontenida para revisores

La Cápsula FAIR (js/analysis/fairCapsule.js) genera un único fichero .html que se abre sin conexión en cualquier navegador. Todo su contenido sale de la sesión; lo que no se ha medido aparece como «—».

24.3 Desconvolución Richardson-Lucy

El microscopio forma la imagen observada O como la convolución del objeto x con la función de dispersión de punto (PSF) H, más un fondo b y ruido de fotones de Poisson. El algoritmo de Richardson-Lucy (Richardson, 1972; Lucy, 1974) busca el objeto de máxima verosimilitud bajo ese modelo mediante la iteración multiplicativa:

que mantiene la estimación no negativa y conserva la intensidad total. La PSF se modela como una gaussiana 3D separable ajustada a la PSF teórica paraxial (Zhang, Zerubia y Olivo-Marin, 2007):

En confocal con pinhole de hasta 1 unidad de Airy ambas se dividen por $\sqrt{2}$ (aproximación $\lambda_{\text{exc}} \approx \lambda_{\text{em}}$). El núcleo se integra sobre cada píxel, de modo que sigue siendo correcto cuando $\sigma$ es menor que el vóxel. El fondo $b$ se estima como el percentil 5 % de las medias de bloques de 16 × 16 píxeles, que no se deja sesgar por el ruido.

El resultado se añade como un canal nuevo («canal · RL n it.») en las mismas unidades de intensidad, en 16 bits; el canal adquirido no se modifica y la huella SHA-256 del conjunto de datos sigue siendo la de los datos adquiridos. En series temporales se desconvoluciona cada instante. El panel informa de lo medido en esa ejecución: el pico sobre el fondo (percentil 99,9 %) después/antes, la intensidad total después/antes, el cambio relativo en la última iteración y el tiempo. El párrafo de Métodos declara la desconvolución con sus parámetros y referencias.

Validación. En un fantasma sintético de 96 × 96 × 32 vóxeles (40 fuentes puntuales emborronadas con la misma PSF, fondo 100 y ruido de Poisson), 20 iteraciones elevaron la correlación con el objeto verdadero de 0,21 a 0,74 y conservaron la intensidad total (× 1,02).

24.4 Superposición molecular AlphaFold DB

Molecular Overlay (js/analysis/molecularOverlay.js) descarga de AlphaFold DB (EMBL-EBI) la estructura predicha de una proteína a partir de su código UniProt; sólo se envía el código. Calcula la fiabilidad pLDDT residuo a residuo (media y fracción en cada banda: > 90 muy alta, 70–90 alta, 50–70 baja, < 50 muy baja, típica de regiones intrínsecamente desordenadas) y dibuja la traza de carbonos α coloreada por pLDDT en el centroide de los spots detectados.

Una proteína mide unos nanómetros, dos órdenes de magnitud por debajo de la resolución óptica (~200 nm): se dibuja ampliada y la aplicación indica el aumento aplicado. La superposición es ilustrativa: ubica la escala molecular en el contexto celular, pero no demuestra que esa proteína ocupe esa posición.

24.5 Control por voz

El control por voz (js/engine/voiceController.js) usa la API de reconocimiento de voz del navegador. En modo local la aplicación interpreta la orden sin IA: vistas («plano frontal», «isométrica»), canales («solo canal verde», «canal azul al 60 %»), modos («modo MIP»), captura y reproducción; si no reconoce la orden, busca un botón visible con ese texto. En modo IA la petición pasa al asistente, que puede encadenar un análisis completo.

24.6 Auditor científico y comprobaciones automáticas

El auditor (js/engine/scientificAuditor.js) avisa con un mensaje en pantalla y, si se activan las alertas habladas, con voz. Hoy comprueba:

• Saturación al importar: en las imágenes del usuario, avisa si más del 5 % de los vóxeles de un canal está en el valor máximo (255 en 8 bits; el máximo presente en 12 o 16 bits). En esos vóxeles la intensidad dejó de ser proporcional a la concentración del fluoróforo, y la cuantificación de intensidad y la correlación de Pearson quedan sesgadas. También señala los canales prácticamente vacíos.
• Desconvolución: rechaza NA ≥ n (físicamente imposible) y avisa por encima de 30 iteraciones.

Otras comprobaciones forman parte de cada módulo: la calibración asumida se anuncia al importar y se declara en el párrafo de Métodos; la colocalización se niega a correlacionar un canal consigo mismo, con un canal derivado de los demás o con su propia desconvolución; la segmentación informa de los objetos rechazados por tamaño; y la desconvolución advierte del submuestreo respecto a Nyquist. Son reglas heurísticas: orientan, pero no sustituyen la revisión experta.

24.7 OME-Zarr (experimental) y Live Sync (en desarrollo)

OME-Zarr: el lector (js/data/zarrStreamer.js) lee los metadatos OME-NGFF (.zattrs o zarr.json) de una pirámide publicada y muestra sus niveles de resolución, ejes y escalas. Si el fichero no declara multiscales, informa del error en lugar de inventar valores. La visualización y el análisis de los bloques aún no están disponibles, y por la política de seguridad de la aplicación sólo se leen pirámides servidas desde el mismo dominio. Para analizar hoy un OME-Zarr, conviértalo a OME-TIFF (por ejemplo con bioformats2raw/raw2ometiff) y cárguelo como pila.

Live Sync: su objetivo es revisar una muestra 3D a la vez con colegas en otros ordenadores (cámara sincronizada, puntero y marcadores). La versión actual no transmite nada entre equipos y sus controles están desactivados. Para compartir un análisis hoy, use la Cápsula FAIR o el CSV con procedencia.

24.8 Protocolo integrado: del análisis al material suplementario

1. Restauración (opcional): desconvolucione el canal de interés con los parámetros de su objetivo (24.3) y compruebe el aviso de muestreo.
2. Análisis: pida al asistente la segmentación y la detección sobre el canal restaurado, o hágalo con los asistentes de Superficies y Puntos.
3. Revisión: atienda los avisos del auditor y revise en la tabla los objetos rechazados por tamaño.
4. Evidencia: descargue la Cápsula FAIR y el CSV; el párrafo de Métodos incluye la desconvolución, los algoritmos, los parámetros y la huella SHA-256.

24.9 Hub de proveedores de IA

El asistente y el modo IA de la voz usan el proveedor configurado en Innovaciones ▾ → ✨ IA y voz. La clave se guarda sólo en este navegador y el proveedor factura el uso en la cuenta del usuario.

Privacidad: al proveedor sólo le llega texto (la conversación, un resumen del estado y los resultados numéricos que consulte el asistente), nunca píxeles ni vóxeles. No escriba datos que identifiquen a un paciente ni los use en nombres de fichero (RGPD).

Tabla de Referencia Rápida: Fluoróforos Comunes, Láseres y Canales